[发明专利]一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法

权利要求书

1.一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于，包括以下步骤：a. 工程菌的固定化处理，采用LB液体培养基培养工程菌制成菌悬液，再经液体发酵培养基培养后得工程菌发酵菌种，以工程菌发酵菌种为固定化对象，采用固定化细胞技术，以聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭对工程菌进行包埋，形成固定化工程菌；b.将固定化工程菌接种到50~80ml液体发酵培养基/250ml锥形瓶培养，温度为28~32℃，在转速为150 ~250r/ min的恒温振荡箱中培养6~12h，用无菌纱布过滤分离得增殖的固定化工程菌；c.将增殖的固定化工程菌按土壤重量3~10％投粒比，均匀分布于供试土壤中，再将100~600mg/kg有机磷农药添加到无菌水中，通过调节土壤含水量时加入，调节含水量达到土壤饱和含水量的40~60％，培养后取样检测土壤中有机磷含量。

2.根据权利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于：所述工程菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 9272，保藏日期：2014年06月05日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

3.根据权利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于，步骤a工程菌的固定化处理的具体步骤为：

（1）采用LB液体培养基28-32℃培养工程菌12-24h制成菌悬液，接种到含有100~600mg/L甲基对硫磷的液体发酵培养基中，装液量为50~80 ml/250ml锥形瓶，摇匀，28~32℃，150~250 r/ min恒温振荡培养24~48 h，获得工程菌发酵菌种；

（2）聚乙烯醇冷水溶胀后加入95℃水中溶解，将聚乙烯醇和活性炭混入海藻酸钠溶液中使三者终浓度分别达到100~120 g/L、8~10 g/L和9~11 g/L，将工程菌发酵菌种与液体发酵培养基用无菌纱布过滤分离，菌种用去离子水清洗后，按照菌种：聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭溶液质量体积比为1:1~2:1的标准取菌种加入聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭溶液中混匀；

（3）用注射器吸取上述混合液滴入8~10g/L的CaCl₂溶液中形成直径为0.3~0.5cm固定化颗粒，室温固定1~3h后，4℃冰箱固定4~6h，再用去离子水冲洗2~4遍后，直接加入液体发酵培养基中增殖或4℃冷藏备用。

4.根据权利要求1所述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于：步骤b中固定化工程菌的培养温度为30℃。

5.根据权利要求3所述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，其特征在于：聚乙烯醇终浓度为120 g/L，海藻酸钠终浓度为10 g/L，活性炭终浓度为11 g/L，CaCl₂溶液的浓度为10g/L。