[发明专利]一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域 ，具体涉及一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法。

背景技术

目前我国约有87～107万hm² 的农田土壤受到有机磷农药污染，种植在农药污染的土壤上的作物从土壤中吸收累积农药，不但影响植物的正常生长发育，而且还会在植物体内残留，导致主要农产品的农药残留超标。大部分农药会落入土壤中，而且不断的进行积累，破坏了土壤微生物的繁殖，使敏感性的菌种受到抑制，土壤微生物的种群趋于单一化，引起原有的平衡紊乱、功能失调从而影响土壤物质和能量的循环，影响土壤微生物的氨化硝化和呼吸作用等，由此破坏了土壤结构和理化性质，影响着作物生长，造成土壤结构板结导致土壤退化、酸化、养分减少、农作物产量和品质下降。

土壤污染的治理主要有物理治理技术、化学治理技术、微生物治理技术、植物治理技术。微生物治理技术有着物理、化学方法无可比拟的优越性，如处理费用低，处理效果好，对环境的影响小，不会造成二次污染，不破坏植物生长所需的土壤环境，处理操作简单等优点。微生物治理技术可通过自然的或人工方式加速土壤残留农药的微生物降解，实现受污染土壤的微生物修复。然而采用传统的游离微生物技术修复受有机磷农药污染的土壤时存在一些缺陷，如反应速度慢、有效降解菌无法形成优势菌群、抗不利环境能力差、对环境变化敏感、与土著菌竞争营养时处于劣势，达不到污染土壤修复的预期目标，而固定化细胞技术有望克服这些缺点和弊端。

固定化细胞技术是将细胞通过化学或物理的方法固定在水溶性或不溶性的颗粒状、管状、膜状的载体之上，使其保持活性并能反复使用的一种技术，较游离菌具有较大优势，可以明显地提高细胞对不利环境的适应能力，能在持续增殖、休眠及衰亡的同时，其活性始终保持稳定，具有降低污染修复成本、节约能源消耗、简化环保方法等很多优点。目前固定化技术己经广泛应用于流体介质中，但在修复非流体介质，尤其是有机磷农药污染的土壤尚未见成功的报道。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术问题，本发明的目的在于提供一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，降解效果好，避免对土壤造成二次污染。

技术方案：为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法，包括以下步骤：

a.工程菌的固定化处理，采用LB液体培养基培养工程菌制成菌悬液，再经液体发酵培养基培养后得工程菌发酵菌种，以工程菌发酵菌种为固定化对象，采用固定化细胞技术，以聚乙烯醇、海藻酸钠、活性炭对工程菌进行包埋，形成固定化工程菌；

   b.将固定化工程菌接种到50~80ml液体发酵培养基/250ml锥形瓶培养，温度为28~32℃，在转速为150 ~250r/ min的恒温振荡箱中培养6~12h，用无菌纱布过滤分离得增殖的固定化工程菌；

   c.将增殖的固定化工程菌按土壤重量3~10％投粒比，均匀分布于供试土壤中，再将100~600mg/kg有机磷农药添加到无菌水中，通过调节土壤含水量时加入，调节含水量达到土壤饱和含水量的40~60％，培养后取样检测土壤中有机磷含量。

作为优选的是，所述工程菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC No. 9272，保藏日期：2014年06月05日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

上述固定化工程菌降解土壤中有机磷农药的方法中步骤a工程菌的固定化处理的具体步骤为：

（1）采用LB液体培养基28-32℃培养工程菌12-24h制成菌悬液，接种到含有100~600mg/L甲基对硫磷的液体发酵培养基中，装液量为50~80 ml/250ml锥形瓶，摇匀，28~32℃，150~250 r/ min恒温振荡培养24~48 h，获得工程菌发酵菌种；

（2）聚乙烯醇冷水溶胀后加入95℃水中溶解，将聚乙烯醇和活性炭混入海藻酸钠溶液中使三者终浓度分别达到100~120 g/L、8~10 g/L和9~11 g/L，将工程菌发酵菌种与液体发酵培养基用无菌纱布过滤分离，菌种用去离子水清洗后，按照菌种：聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭溶液质量体积比为1:1~2:1的标准取菌种加入聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭溶液中混匀；