[发明专利]一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法

权利要求书

1.一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法，包括如下步骤：

1)种子细胞活化

将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为5％的培养基活化，培养两代后，再用血清含量为2％的培养基培养2代；

2)种子细胞的无血清驯化

从2％浓度开始，逐渐降低培养基中血清的含量，连续驯化种子细胞，检测细胞活力；待细胞完全适应无血清悬浮培养基之后，停止驯化；

3)种子细胞在生物反应器中的培养

在生物反应器中接入驯化后的种子细胞(初始密度50万/ml)，反应器参数设定为：转速80转/分，培养温度37℃，溶氧为30-45％，pH值为7.2-7.4；采用半连续流加方式培养细胞；

4)狂犬病毒株的增殖

将狂犬病毒株以2％(v/v)比例接种生长良好的单层种子细胞，培养48-72小时，当病变达到80-100％时，收获狂犬病毒液，测定病毒滴度；

5)接种病毒

当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/mL时，按MOI＝0.1接种步骤4)获得的狂犬病毒液；

6)病毒大规模扩增

生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值40％，温度为32℃；

7)病毒收获

狂犬病毒接种72小时后开始收毒，每次收毒2/3体积，隔天再收一次并添加新鲜无血清培养基，收毒2-5次之后，细胞活力降低到80％以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，-80℃保存备用。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述种子细胞为BHK21细胞或vero细胞。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述生物反应器为搅拌式生物反应器，反应器容积为5L、50L或300L。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述半连续流加方式培养细胞，是将50倍氨基酸-维生素浓缩液，按照第3天10％(v/v)，第5天10％(v/v)，第6天10％(v/v)，第7天10％(v/v)，第8天5％(v/v)，第9天5％(v/v)，第10天5％(v/v)，第11天5％(v/v)流加入反应器中用于培养细胞。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述狂犬病毒株为Flury或AG毒株。

6.权利要求1-5任一所述方法在狂犬病毒疫苗制备中的应用。