[发明专利]一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗生产技术领域，具体提供了一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法。

背景技术

1962年，Capstick等对BHK21细胞驯化实现悬浮培养，并用于兽用疫苗生产。1967年，Van Wezel开发了微载体并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养与微载体培养标志着细胞大规模培养技术的开始，细胞生产病毒疫苗也成为细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。到了20世纪八九十年代，CHO细胞实现悬浮培养，治疗性抗体生产技术的发展极大地推动着生物反应器在生物制药行业中的应用，到20世纪末已进入万升级规模。2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，作为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。当今生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式反应器中，用无血清培养基和流加培养工艺悬浮培养细胞进行生产。

狂犬病俗称“恐水症”，是由狂犬病毒引起的人兽共患中枢神经系统传染病，临床表现以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等为主要特征，是迄今为止人类唯一病死率高达100％的急性传染病。《中华人民共和国传染病防治法》将狂犬病列为乙类传染病。最早制造狂犬疫苗的是法国的巴斯德。1882年它成功地应用连续传代减弱病毒毒力的方法，用适应毒种来制造疫苗。中国现在制造的狂犬疫苗系用狂犬病毒固定毒接种于原代地鼠肾细胞，培养后，收获毒液，经浓缩、纯化、精制并加氢氧化铝佐剂，经全面检定合格后即为预防狂犬病的疫苗。

如何通过无血清培养和生物反应器悬浮培养工艺进一步提高兽用狂犬疫苗的质量和产量，是目前本领域的研究热点和难点。

发明内容

本发明的目的是提供一种培养狂犬病毒的方法。具体是通过无血清培养技术，结合悬浮培养的方式，实现狂犬病毒的大规模扩增，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。

本发明一方面提供了一种无血清悬浮培养狂犬病毒的方法，包括如下步骤：

1)种子细胞活化

将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为5％的培养基活化，培养两代后，再用血清含量为2％的培养基培养2代；

2)种子细胞的无血清驯化

从2％浓度开始，逐渐降低培养基中血清的含量，连续驯化种子细胞，检测细胞活力；待细胞完全适应无血清悬浮培养基之后，停止驯化；

3)种子细胞在生物反应器中的培养

在生物反应器中接入驯化后的种子细胞(初始密度50万/ml)，反应器参数设定为：转速为80转/分，培养温度为37℃，溶氧为30-45％，pH值为7.2-7.4；采用半连续流加方式培养细胞；

4)狂犬病毒株的增殖

将狂犬病毒株以2％(v/v)比例接种生长良好的单层种子细胞，培养48-72小时，当病变达到80-100％时，收获狂犬病毒液，测定病毒滴度；

5)接种病毒

当生物反应器中种子细胞的浓度达到100万/mL时，按MOI＝0.1接种步骤4)获得的狂犬病毒液；

6)病毒大规模扩增

生物反应器设定参数为：转速80转/分钟，DO值40％，温度为32℃；

7)病毒收获

狂犬病毒接种72小时后开始收毒，每次收毒2/3体积，隔天再收一次并添加新鲜无血清培养基，收毒2-5次之后，细胞活力降低到80％以下，停止收毒；毒液收集于塑料容器中，-80℃保存备用。

其中所述种子细胞为BHK21细胞或vero细胞；

所述生物反应器为搅拌式生物反应器，反应器容积为5L、50L或300L；

步骤3)所述半连续流加方式培养细胞，是将50倍氨基酸-维生素浓缩液，按照第3天10％(v/v)，第5天10％(v/v)，第6天10％(v/v)，第7天10％(v/v)，第8天5％(v/v)，第9天5％(v/v)，第10天5％(v/v)，第11天5％(v/v)流加入反应器中用于培养细胞；

所述狂犬病毒株为Flury或AG毒株；

本发明另一方面提供了上述方法在狂犬病毒疫苗制备中的应用。

有益效果

利用本发明所述方法，BHK21种子细胞的活力高于95％，密度达到5×10⁶cell/ml，狂犬病毒滴度大于或等于10⁸。所述方法生产工艺稳定，重复性好，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。

附图说明

图1为BHK21细胞无血清驯化过程。

图2为无血清批式培养的BHK21细胞生长曲线。