[发明专利]十字花科蔬菜根肿病菌DNA的提取方法及应用

权利要求书

1.一种十字花科蔬菜芸薹根肿菌DNA的提取方法，其特征是采用硅藻土法提取根肿菌孢子DNA，具体步骤包括：

(1)将1g感病病根压扁，释放出孢子，与50mL的灭菌蒸馏水混匀，16层纱布过滤，滤液再次通过中速滤纸过滤，分装到50 mL的离心管中，滤液4500 rpm，离心10分钟，弃去上清溶液，沉淀继续用50 mL 经过灭菌的蒸馏水溶解，滤液4500 rpm，离心10分钟，再滤液4500 rpm，离心10分钟；将第三次离心获得的沉淀中加入5 mL 25%(w/v)浓度的蔗糖3100 rpm，离心5分钟，倒掉上清液，沉淀重新溶于30 mL 蒸馏水中，混匀，3100 rpm，离心5分钟；沉淀用30 mL 蒸馏水悬浮，即获得根肿病菌孢子悬浮液；将制备的孢子悬浮液（≥10⁸个）4000 rpm，离心5分钟，去掉上清液，沉淀用1mL 灭菌的蒸馏水悬浮，4℃保存，用于DNA提取；

(2)在含有1 mL根肿病菌孢子悬浮液的离心管中加入200 μL异硫氰酸胍缓冲液（50 mL缓冲液含0.2 M异硫氰酸胍，0.25 g EDTA，40 mM Tris-HCl）混匀，室温放置10分钟，8000 rpm，离心30秒；

(3)将上清液转入另一离心管中，加入20 mg/mL RNA酶，37℃水浴30分钟；

(4)加入30 μL硅藻土吸附液（1g硅藻土与1×TE缓冲液比例为1:1（w/v）混合，其中1×TE缓冲液含100mM Tris-Hcl和10mM EDTA），震荡均匀后室温放置15分钟，13000 rpm，离心30秒，弃去上清液；

(5)沉淀中继续加入200 μL 异硫氰酸胍缓冲液，混匀后室温放置10分钟，8000 rpm，离心30秒，弃上清；

(6)沉淀用洗涤缓冲液（每500 mL洗涤缓冲液含60%(v/v)乙醇，20 mM Tris-HCl，EDTA 0.25 g，400 mM NaCl）洗涤沉淀3次，每次300 μL，然后用200 μL 70%(v/v)乙醇洗涤沉淀，13000 rpm，离心2分钟，弃上清，沉淀在室温放置1小时；

(7)向沉淀中加入30 μL蒸馏水，在涡旋振荡器上充分混匀，55℃水浴10分钟，13000 rpm，离心5分钟，上清液即为DNA提取液；

（8）分别利用分子标记TCR01和TC01进行PCR扩增，以扩增产物中是否含有寄主的部分PCR片段来识别样品中是否含有寄主DNA污染。

2.一种如权利要求1所述十字花科蔬菜芸薹根肿菌DNA提取方法的应用，其特征是：本发明方法在十字花科植物根肿病菌生理小种分子鉴定、抗根肿病育种中的应用。