[发明专利]十字花科蔬菜根肿病菌DNA的提取方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物病菌DNA的提取方法，具体是一种用于隔离寄主污染的病原菌DNA提取方法。

背景技术

十字花科蔬菜根肿病是由芸薹属根肿病菌侵染引起的一种世界性病害，任何十字花科蔬菜的感病品种都会被这一病原菌侵染。在环境条件有利于病害发生的情况下可导致十字花科蔬菜产量严重下降，甚至绝收。

根肿病菌生理小种分化比较多，致使根肿病很难防治。国内十字花科根肿病发生面积比较大，分布也较广泛，沈向群等（2009）从辽宁、山东、云南、四川、吉林等地区采集的大白菜根肿病菌采用Williams 鉴别寄主系统初步鉴定出了16个生理小种的优势菌群。但Williams 鉴别寄主系统对一些生理小种鉴别存在界限模糊等问题，尚需结合病原菌的分子差异加以进一步甄别。

植物的抗病性即与其本身的基因有关，也与病原物的基因有关。正确认识寄主植物与病原菌的基因互作关系，对于全面了解植物的抗病性具有极为重要的作用。所以无论是植保研究还是抗病育种，都需要快速准确的分离和鉴定生理小种，才能有针对性地进行防治和抗病育种。根肿病菌侵入十字花科植物根内，主要以孢子、游动孢子及孢子囊的形式在寄主根内生存。该菌是一种专性寄生菌，目前尚未能在人工合成的培养基上培养。因此在从植株根肿组织中提取病原菌基因组DNA时，都无法避免寄主DNA的污染，影响了从分子水平探究不同生理小种的致病性差异。所以研究根肿病菌作用的分子机制需要去除寄主DNA污染是急待解决的问题。吴少慧等曾报道利用硅藻土法提取痕量放线菌DNA^[3]；陈强、吴少慧等人利用硅藻土法从豆科根瘤直接提取根瘤菌DNA^[4,5]。由于根肿病菌侵入十字花科植物根后主要以孢子、游动孢子及孢子囊的形式在寄主根内生存，而目前常用的分离根肿菌DNA的方法均存在寄主植物DNA分子的污染，尚未见利用硅藻土法提取根肿病菌的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，公开了一种通过硅藻土隔离寄主进行根肿病菌DNA的提取方法，有利于从分子水平准确鉴定根肿病菌生理小种，进行十字花科蔬菜抗源材料的抗性鉴定，从而缩短十字花科抗根肿病蔬菜新品种的育种周期，加快育种进程。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、硅藻土法提取根肿菌孢子DNA，具体步骤包括：

(1)将1g感病病根压扁，释放出孢子，与50mL的灭菌蒸馏水混匀，16层纱布过滤，滤液再次通过中速滤纸过滤，分装到50 mL的离心管中，滤液4500 rpm，离心10分钟，弃去上清溶液，沉淀继续用50 mL 经过灭菌的蒸馏水溶解，滤液4500 rpm，离心10分钟，再滤液4500 rpm，离心10分钟；将第三次离心获得的沉淀中加入5 mL 25%(w/v)浓度的蔗糖3100 rpm，离心5分钟，倒掉上清液，沉淀重新溶于30 mL 蒸馏水中，混匀，3100 rpm，离心5分钟；沉淀用30 mL 蒸馏水悬浮，即获得根肿病菌孢子悬浮液；将制备的孢子悬浮液（≥10⁸个）4000 rpm，离心5分钟，去掉上清液，沉淀用1mL 灭菌的蒸馏水悬浮，4℃保存，用于DNA提取；

(2)在含有1 mL根肿病菌孢子悬浮液的离心管中加入200 μL异硫氰酸胍缓冲液（50 mL缓冲液含0.2 M异硫氰酸胍，0.25 g EDTA，40 mM Tris-HCl）混匀，室温放置10分钟，8000 rpm，离心30秒；

(3)将上清液转入另一离心管中，加入20 mg/mL RNA酶，37℃水浴30分钟；

(4)加入30 μL硅藻土吸附液（1g硅藻土与1×TE缓冲液比例为1:1（w/v）混合，其中1×TE缓冲液含100mM Tris-Hcl和10mM EDTA），震荡均匀后室温放置15分钟，13000 rpm，离心30秒，弃去上清液；

(5)沉淀中继续加入200 μL 异硫氰酸胍缓冲液，混匀后室温放置10分钟，8000 rpm，离心30秒，弃上清；

(6)沉淀用洗涤缓冲液（每500 mL洗涤缓冲液含60%(v/v)乙醇，20 mM Tris-HCl，EDTA 0.25 g，400 mM NaCl）洗涤沉淀3次，每次300 μL，然后用200 μL 70%(v/v)乙醇洗涤沉淀，13000 rpm，离心2分钟，弃上清，沉淀在室温放置1小时；

(7)向沉淀中加入30 μL蒸馏水，在涡旋振荡器上充分混匀，55℃水浴10分钟，13000 rpm，离心5分钟，上清液即为DNA提取液。

2、PCR扩增