[发明专利]一种细胞膜靶向一氧化氮荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过荧光成像来检测细胞中一氧化氮释放的细胞膜靶向荧光探针及其制备方法和应用，属于一氧化氮的生物检测技术领域。

背景技术

一氧化氮(NO)作为生理过程中重要的信号分子之一，在心血管系统、神经系统以及免疫系统中起着举足轻重的作用，因此对于生物体内NO含量的分析研究具有重大意义。近些年来发展了很多NO分析方法，包括化学发光法、比色法、电子自旋共振法、电化学法和荧光分析法，其中荧光分析法以其高选择性和高灵敏度的优势备受研究者的关注，产生了一系列以邻苯二胺为反应基团，以罗丹明、荧光素、花菁、二氟化硼二吡咯甲烷(BODIPY)等为荧光团的小分子荧光探针；含Cu²⁺、Fe³⁺等金属离子的金属配合物荧光探针；基于荧光共振能量转移的双光子荧光探针等。然而，所有这些探针都标记在细胞内部，通过荧光强度的变化来提供细胞内部NO的信息。但是通过细胞膜释放到胞外的NO在细胞间信号传递、免疫防御以及舒张血管等生理过程中的作用也不能小觑，而现有的荧光探针都不能实现对这部分NO的检测。因此，设计合成一种细胞膜靶向NO荧光探针，用于原位实时检测从细胞中释放出来的NO，对研究NO的生理功能和相关疾病的出现与治疗具有重要的指导意义。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提供一种能够靶向标记在细胞膜外表面的细胞膜靶向一氧化氮荧光探针，以用于对细胞释放到胞外的一氧化氮的检测，为一氧化氮参与的生理过程研究和疾病研究提供新方法。

本发明所采用的技术方案具体如下：

一种细胞膜靶向一氧化氮荧光探针，具有通式(I)所示的结构：

其中，R₁为C₈～C₁₆直链烷基；R₂为-SO₃H或-SO₃Na。

在R₁位置上引入与细胞膜磷脂结构类似的长链疏水端，可实现氟硼吡咯烷对细胞膜的靶向性标记；同时，在R₂位置上引入水溶性基团，可一定程度上增强氟硼吡咯烷的水溶性，阻止其穿透细胞膜进入细胞内部，从而实现对细胞释放到细胞外的一氧化氮的检测。

一种制备上述细胞膜靶向一氧化氮荧光探针的方法，包括以下步骤：

(1)无水无氧条件下，将3,4-二硝基苯甲酰氯溶于二氯甲烷中，滴入C₈～C₁₆直链烷基吡咯的二氯甲烷溶液，室温搅拌24～48小时；反应结束，简单提纯后将提纯物溶于无水二氯甲烷中，降温至0～-10℃，在氮气保护下滴入2,4-二甲基吡咯和三氯氧磷，室温继续搅拌12～36小时，然后滴加三乙胺、三氟化硼乙醚，室温反应至薄层层析显示原料已反应完全；经提纯得到紫红色粉末化合物A；其中，3,4-二硝基苯甲酰氯、直链烷基吡咯、2,4-二甲基吡咯、三氯氧磷、三乙胺、三氟化硼乙醚的摩尔比为1.1～1.3：1：1～1.2：1～1.2：3～5：3～5；

(2)将化合物A溶于无水二氯甲烷，降温至-50℃～-40℃，氮气保护下滴加氯磺酸，滴加完毕，缓慢升至室温，待原料反应完全，加弱碱调节pH至7～8，停止反应；经提纯得到暗红色化合物B；其中，化合物A、氯磺酸的摩尔比为1：2～8；

(3)将化合物B溶于无水乙醇，氮气保护下加入水合肼和钯碳，加热回流3～5小时，反应完全后过滤除去钯碳，滤液旋干后经提纯得到上述细胞膜靶向一氧化氮荧光探针；其中，化合物B、水合肼、钯碳的摩尔比为1：5～10：0.5～1.5。

所述的C₈～C₁₆直链烷基吡咯为2-十六烷基吡咯、2-十二烷基吡咯或2-八烷基吡咯。

所述的弱碱为碳酸氢钠。

上述细胞膜靶向一氧化氮荧光探针在一氧化氮检测领域的应用。

本发明提供的细胞膜靶向一氧化氮荧光探针，其荧光性质基于光诱导电子转移机制(PET)，该荧光探针本身荧光强度很弱，在生理条件下可选择性地与NO发生反应，生成具有强荧光的衍生物，且不受生物体中其它常见活性氮氧化合物的干扰。该探针合成方法简单，其包含的饱和长链烷基可插入到细胞膜中实现非共价标记，同时水溶性基团保证探针只标记在细胞膜的外表面而不会进入到细胞内部，适合于检测通过细胞膜释放到胞外的一氧化氮。

本发明具有以下优点和有益效果：