[发明专利]使用生长因子组合的骨髓干细胞和间充质干细胞之骨生成分化

说明书

本申请是中国专利申请200980105172.2的分案，后者是2009年1月9日提交的PCT申请PCT/EP2009/050209于2010年8月13日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及骨髓干细胞(bone marrow stem cell，BMSC)和间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的骨生成分化方法，涉及可由所述方法获得的细胞和细胞群，还涉及其用途特别是在骨治疗领域中的用途。

背景技术

移植能够进行骨生成分化的干细胞或者定向于骨生成分化的细胞是治疗骨相关疾病(特别是当所述治疗需要新骨产生时)的有前景的途径。

先前已使用骨髓干细胞(BMSC)和间充质干细胞(MSC)治疗骨疾病(Gangji等，2005，Expert Opin Biol Ther 5：437-42)。然而，尽管可以将这些相对未分化的干细胞进行移植，但是它们并不定向分化为骨生成谱系，因此这样移植的干细胞中有相当大的比例最终可能不会形成期望的骨组织。

而且，可从骨髓或其它来源组织获得的这些干细胞的量常常不能令人满意并且在多种环境下还可能减少，例如由使用糖皮质激素或滥用酒精或遗传原因所致。

WO 2007/093431公开了一种使分离的BMSC或MSC在体外充分扩增并获得已显示出成骨表型之细胞的方法。在所述方法中，人BMSC或MSC在血清或血浆以及碱性成纤维细胞生长因子(FGF)存在下培养。WO 2007/093431未教导使用特定的FGF和TGF生长因子组合用于获得成骨细胞并且未提示其任何优点。

需要另外的简单可靠的方法用于从BMSC和MSC产生可用的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。特别期望这些方法可实现更大程度的细胞扩增和/或产生具有额外有利性质的细胞，例如在同种异体对象中导致较低组织排斥的细胞。

本发明的一个目的是提供这样的方法以及由此获得的成骨细胞表型细胞。

发明内容

本发明人发现，当在血清或血浆、成纤维细胞生长因子(FGF)以及转化生长因子β(TGFB)存在下进行培养时，成体干细胞(更具体地，骨髓干细胞(BMSC)和间充质干细胞(MSC))的扩增潜力可在骨生成分化后大大增加，由此可实现可用的骨原细胞或成骨细胞表型细胞及细胞群的数量增加。

因此，在一方面中，本发明提供了用于从人骨髓干细胞(BMSC)或人间充质干细胞(MSC)体外或离体获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的方法，包括使所述BMSC或MSC与人血浆或血清、成纤维细胞生长因子(FGF)或者其生物活性变体或衍生物、以及转化生长因子β(TGFB)或者其生物活性变体或衍生物相接触。

本发明的方法可以将显著部分(例如大多数)的经处理干细胞向骨原细胞或成骨细胞表型分化。因此，在一个方面中，本发明的方法可用于获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞本身。

然而，应当理解，本发明的方法通常可产生骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞占显著部分(例如大多数)的细胞群。这样的细胞群任选地可包含其它细胞类型。

因此，在一方面中，本发明涉及用于从人BMSC或人MSC体外或离体获得包含骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞之细胞群的方法，包括使所述BMSC或MSC与人血浆或血清、FGF或者其生物活性变体或衍生物、以及TGFB或者其生物活性变体或衍生物相接触。

本发明方法允许产生用于移植目的的大量骨生成细胞。这使得进一步减少了为获得初始BMSC或MSC细胞而需要从对象取出的组织的量。其还允许从对象中获得具有减少的BMSC或MSC细胞数的足够量的骨生成细胞。同时，所述方法使得缩短了经分化细胞可移植进患者的时间，因此导致治疗更快捷。

在一个实施方案中，本发明的上述方法可包括以下步骤：

(a)从包含BMSC或MSC的人对象生物样品中回收细胞；

(b)任选地，从(a)中回收的细胞分离单个核细胞；

(c)将(a)或(b)的细胞添加至包含人血浆或血清、FGF或者其生物活性变体或衍生物以及TGFB或者其生物活性变体或衍生物的培养基，并培养该细胞-培养基混合物，从而使细胞贴附至基底表面；

(d)除去未贴附物，并继续在(c)中所限定之培养基中培养贴附细胞，从而获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞样细胞，或者包含这些细胞的细胞群。