[发明专利]一种基于荧光共振能量转移检测双酚A的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移检测BPA的方法。

背景技术

荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，简称FRET)是处于激发态的供体分子通过远程偶极作用将自身能力转移给近距离的处于基态的受体分子的非辐射过程。受体分钟必须能吸收供体发射波长处的能量，故受体分子的激发波长必须与供体分子的发射波长重叠。自F?rster（F?rster T. Annals of Physics, 1948, 2:55）首次阐述了FRET的机制以来，FRET广泛应用于核酸研究、蛋白质研究、细胞研究、免疫测定等领域。

核酸适配体（aptamer），来源于拉丁文“aptus”，简称适配体，又称核酸适体或核酸适配子，是一段由25-80个RNA或DNA碱基组成的寡核苷酸片段。适配体可以与目标物通过适应性折叠相结合，形成发卡（hairpin）、假结（pseudoknot）、凸环（bulge）、G-四链体（G-quartet）等特殊的三维结构。自从1990年Tuerk等（Tuerk C., Gold L. Science 1990, 249, 505）首次利用指数富集系统进化的体外筛选技术（SELEX）筛选出噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA型适配体以来，适配体的研究工作得到了快速发展。仅1999年，NeXstar Pharmaceuticals公司和Colorado大学就筛选出超过100种的适配体。Ellington小组已经创建了一个适配体数据库，里面包含了适配体的详细信息。

双酚A（Bisphenol A，简称BPA）全名2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，用于合成聚碳酸酯和环氧树脂等材料，也可用作酚醛树脂、可塑性聚酯、抗氧剂及聚氯乙烯的稳定剂，被广泛用于制造婴儿奶瓶、厨房用具及医疗设备。已有研究表明，BPA有模拟雌激素的效果，是一种环境激素，可通过包装材料进入食品和饮料中，导致人体内分泌失调，威胁胎儿和儿童健康，还可能与癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖有关。因此，建立一种操作简便、灵敏度高的BPA检测方法是十分必要的。本发明利用荧光共振能量转移技术，采用有机荧光染料羟基荧光素（FAM）作为FRET的供体分子、羧基四甲基罗丹明（TAMRA）作为FRET的受体分子，利用BPA适配体与BPA特异性结合的原理，可准确测定样品中BPA的含量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，该检测方法对BPA的检测灵敏度高、特异性好，在1.0×10^-10-1.0×10^-8 mol/L浓度范围内对BPA的检测呈现良好的线性，最低检测限为7.0×10^-11 mol/L，可实现BPA的快速、准确测定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于荧光共振能量转移检测BPA的方法，是基于BPA适配体与BPA特异性结合的原理，利用荧光共振能量转移检测BPA的含量；

包括以下步骤：

1）将DNA以8000 r/min的转速离心5 min后，加入50 mmol/L、pH值为7.4的BR缓冲液中充分振荡5-10 min，放入4℃冰箱备用；

2）将步骤1）中的DNA加入到50 mmol/L、pH值为7.4的BR缓冲液中，再加入D1、T1和T2，杂交反应2 h；

3）检测步骤2）反应后溶液的荧光信号，记为初始荧光信号值F₀；

4）向步骤3）检测后的溶液中加入待测溶液，特异性结合10 h；

5）检测步骤4）反应后溶液的荧光信号，记为反应荧光信号值F；

6）根据BPA浓度与荧光强度变化值的线性方程计算出BPA的浓度，进而得出待测溶液中BPA的含量。

步骤2）加入DNA后，BR缓冲液中DNA的浓度为1.0×10^-7 mol/L。

步骤2）所述D1为BPA适配体探针，其序列为：5’–TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTGGATTTTTTATTTCTGGGGTTCAGTTCTTTTTTGT-3’（SEQ ID NO:1）。

步骤2）所述T1为BPA适配体互补链1探针，其序列为：5’–FAM-ATCCAGAAACGCGAACGA-3’（SEQ ID NO:2）。