[发明专利]一种同时检测玉米中产AFB1、ZEN、DON真菌的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种利用多重PCR方法同时检测玉米中存在的产黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素真菌的方法，属于饲料技术领域。 

(二)背景技术

玉米在大田、储存和运输过程中均可感染多种霉菌，如曲霉属、青霉属、镰刀菌属真菌等，而且玉米所含有的营养成分及合适的水分含量，极适宜这些真菌的生长，并利于其产生霉菌毒素，其中最主要的霉菌毒素是黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)。这些霉菌毒素造成饲料的饲喂价值降低，对畜禽的组织功能、健康产生不利影响，甚至导致死亡，影响养殖效益。因此，对于霉菌毒素以及产毒真菌的检测显得至关重要。目前常用的检测方法包括薄层层析、液相色谱、免疫化学分析等，主要基于对所产生的霉菌毒素的检测，无法检出己被产毒真菌污染但尚未产毒的高风险样品。多重PCR检测方法，可在单一泳道反应体系中同时检测多个DNA模板或同一模板的不同区域，具有快捷、高效、低成本等优点，被广泛应用于有害微生物检测，因此该方法可用于对产毒真菌进行检测。 

(三)发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种同时检测玉米中AFB1、ZEN、DON真菌的方法；目的是设计了三对引物并将其组合，同时建立起三对引物组合的多重PCR反应条件，提供了一种多重PCR法，用于同时扩增编码AFB1、ZEN、DON等毒素合成的基因aflR、PKS13、tri5，实现对玉米中可能存在的具有产毒风险的真菌进行检测。 

本发明是这样实现的：对玉米样品中的DNA进行提取，分别根据编码AFB1、ZEN、DON合成的基因aflR、PKS13、tri5设计筛选了三对引物组合，并筛选出三种引物组合的多重PCR反应条件，采用多重PCR法对所提取的DNA中的三个目的基因进行扩增，从而建立一个能够同时检测玉米中三种产毒素真菌的方法，实现对玉米中潜藏性产毒素真菌的预警。 

一种同时检测玉米中产黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素真菌的方法，包括以下步骤： 

1、根据Genebank上已发表的aflR、PKS13和tri5基因序列，设计的引物组合为：一对针对aflR的特异性引物SEQ1和SEQ2；一对针对PKS13的特异性引物SEQ3和SEQ4；一对针对tri5的特异性引物SEQ5和SEQ6； 

SEQ1：5'-GCACCCTGTCTTCCCTAACA-3' 

SEQ2：5'-ACGACCATGCTCAGCAAGTA-3' 

SEQ3：5'-CTGAGAAATATCGCTACACTACCGAC-3' 

SEQ4：5'-CCCACTCAGGTTGATTTTCGTC-3' 

SEQ5：5'-GCTGCTCATCACTTTGCTCAG-3' 

SEQ6：5'-CTGATCTGGTCACGCTCATC-3' 

2、常规方法提取玉米样品DNA,进行PCR反应；反应体系为： 

10×Taq PCR Buffer(含Mg²⁺)：2.5μL； 

dNTP Mix(2.5mM each)：2.0μL； 

引物aflR、PKS13、tri5的上游引物各1.0μL，下游引物各1.0μL； 

提取到的DNA：500ng； 

Taq DNA酶(5U/μL)：0.25μL； 

用不含RNA酶的灭菌水定容至25μL。 

多重PCR扩增程序如下： 

首轮循环：预变性，94℃，2min； 

中间循环：变性，94℃，30s；复性，60℃，30s；延伸，72℃，30s；进行30个循环 

末轮循环：延伸，72℃，10min。 

3、对步骤2)得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶检测:如果从样品中扩增出192bp的产物，则待检玉米样品中有产生ZEN的真菌；如果从样品中扩增出400bp的产物，则待检玉米样品中有产生AFB1的真菌；如果从样品中扩增出658bp的产物，则待检玉米样品中有产生DON的真菌。 

本发明的有益效果是：作为一种可同时检测产AFB1、ZEN、DON真菌的方法，适用于生产中对玉米中潜藏性产毒素真菌的检测，简单准确，可以实现对玉米原料是否受到真菌污染的准确把握，进而预防原料毒素超标引起的饲料产品质量问题。 

(四)附图说明 

图1第1批次玉米样品多重PCR扩增结果