[发明专利]将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法

说明书

技术领域

本发明涉及固定细胞的方法，具体地涉及一种将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法。

背景技术

细胞是生命体结构和生命活动的基本单元，研究细胞内分子间相互结合的作用对揭示生命规律，尤其是疾病的发生机制，具有十分重要的意义。

细胞原位电泳(cell in situ electrophoresis)，是将待检细胞制备成单细胞悬液，使其单个游离的细胞分散于等渗即应力平衡的介质中，在电场作用下，将细胞中的物质从细胞中分离出来的一种电泳方式。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的细胞进行计数和分析。

将细胞原位电泳与流式细胞分析术结合使用可以实现对细胞内蛋白质与核酸等物质结合状态的定量分析与分选。但目前尚未有一种能够适用于细胞原位电泳与流式细胞分析术结合配套的细胞固定方法，既可保持细胞的应力平衡、耐受细胞原位电泳过程，又可保证流式细胞术的样品处理与检测过程得以完成。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，包括以下步骤：

(1)取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定1-6(优选3)秒钟，终止固定；

(2)将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X-100 200μl进行细胞打孔5-15(优选10)分钟；

(3)将打孔后的细胞用PBS冲洗后，将冲洗后的细胞中加入电泳缓冲液制成细胞悬液；

(4)恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70％的乙醇固定，固定22-26(优选24h)。

PBS的pH为7.4。

本发明产生的有益效果：

本发明采用了二次固定的方法，第一次固定时使用4％的多聚甲醛预固定1-6秒钟，使细胞在保持其既有应力结构以及细胞内待检蛋白非变性的状态下，经受细胞原位电泳过程，而不发生破碎，利于后续的打孔，保证细胞在打孔的过程中不破裂；若不进行第二次固定，细胞在进行后续的检测过程中会出现破裂，无法进行流式细胞分析术检测，通过二次固定保证检测结果的准确性。

附图说明

图1为细胞原位电泳装置主视图，其中1.电泳缓冲液池，2.滤膜，3.侧连接通道，4.细胞电泳槽；

图2为正常人胚肺成纤维细胞核大小影响SSB结合状态的检测图，其中2a显示RPA32、RPA70和POT1检测结果；2b和2c分别为HFLF在贴壁与胰蛋白酶消化悬浮状态的细胞核荧光染色图。

具体实施方式

实施例1

将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，包括以下步骤：(1)取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定1秒钟，用PBS终止固定；

(2)将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X-100进行细胞打孔5分钟；

(3)将打孔后的细胞用PBS冲洗后，将冲洗后的细胞中加入电泳缓冲液(三羟甲基氨基甲烷Tris:25mM；甘氨酸Glycine:192mM；葡萄糖Glucose:43.2mM；pH8.3)制成细胞悬液；

(4)恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70％的乙醇固定，固定22h。

实施例2

将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，包括以下步骤：(1)取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定6秒钟，终止固定；

(2)将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X-100 200μl进行细胞打孔15分钟；

(3)将打孔后的细胞用PBS冲洗后，将冲洗后的细胞中加入电泳缓冲液(三羟甲基氨基甲烷Tris:25mM；甘氨酸Glycine:192mM；葡萄糖Glucose:43.2mM；pH8.3)制成细胞悬液；

(4)恒压条件下进行电泳，电泳完成后收集电泳缓冲液，将收集到的电泳缓冲液用70％的乙醇固定，固定24h。

实施例3

将细胞原位电泳与流式分析术结合的细胞固定方法，包括以下步骤：(1)取待检测的细胞团加入4％的多聚甲醛预固定3秒钟，终止固定；

(2)将预固定后的细胞团中加入0.2％Triton X-100 200μl进行细胞打孔10分钟；