[发明专利]保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置及方法

权利要求书

1.一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs 结合状态的方法，具体包括以下步骤：

（1）细胞预固定：分离细胞，加入磷酸盐缓冲液制成细胞悬液，将上述细胞悬液涂布于培养皿底部，将上述培养皿置于≤0℃条件下用UV 灯照射后，用磷酸盐缓冲液收集培养皿中的细胞，离心弃上清液后加入4%的多聚甲醛预固定1-6sec，预固定完成后加入打孔剂，所述打孔剂能使细胞膜和细胞和都打孔，打孔5-15min；

（2）细胞原位电泳：将上述打孔后的细胞团加入电泳缓冲液制成细胞悬浮，恒压模式下，在电泳槽阴极侧滴入细胞悬液，电泳完成后用移液器吸净电泳槽中的液体，并将吸出液汇集于一离心管中，用电泳缓冲液冲洗电泳槽，重复电泳过程，直至细胞悬液全部完成电泳；

（3）检测：使用流式细胞术分析检测。

2.如权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中用254 nm UV 灯以1.84W/cm²强度照射，总剂量 165.6J/cm²。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中离心为在260g离心5min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中所述预固定3sec。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中所述打孔为用0.2% Triton X-100打孔10min。

6.如权利要求1 所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中CISE 缓冲液为浓度为Tris：

25 mM；Glycine：192 mM；Glucose：43.2 mM，pH8.3。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞原位电泳的具体步骤为：

（1）细胞团加入CISE 缓冲液制成分散悬浮液；

（2）取上述部分细胞悬液加入离心管作为CISE 的对照，剩余细胞悬液用作CISE 样本；

（3）装配CISE 装置，并连接电泳电源；

（4）加入CISE 缓冲液；

（5）开启电源，设置为恒压模式，调整电压设置到500V 并开始电泳运行；

（6）根据CISE 装置的大小吸取CISE 样品滴入阴极侧电泳槽；

（7）样品滴入后立即开始计时，计时结束，中止电源；

（8）用移液器吸净电泳槽中的液体，并将吸出液汇集于离心管中；

（9）用CISE 缓冲液冲洗电泳槽，吸净残留液，按步骤4 标准重新将电泳槽注入CISE电泳缓冲液；

（10）重复步骤6-9，直至全部CISE 样品被CISE 处理完毕；

（11）分别用CISE 缓冲液补加CISE 样品汇集管和CISE 对照管的液量至相同；

（12）将CISE 样品和CISE 对照以1275g 转速离心5 分钟，弃上清；

（13）分别将CISE 样品和CISE 对照加入PBS 制成细胞分散悬浮；

（14）分别将CISE 样品和CISE 对照用70%的乙醇或4%的多聚甲醛固定。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤6）阴极侧电泳槽开口1.5cm处滴入CISE 缓冲液。

9.如权利要求7 所述的方法，其特征在于，所述步骤14）固定24h。

10.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，该方法所基于的装置，包括：细胞电泳槽：该槽为一内径0.76～0.84 cm、外径0.90～1.00 cm、长度18.9～17.1cm 的圆管，管壁中部，沿其纵轴方向开有一8.55×0.57cm～9.45×0.63cm的槽口；电泳缓冲液池：阳极、阴极各有一个，尺寸相同，9.5×3.33×4.75cm～10.5×3.68×5.25cm；侧连接通道：阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，内径0.76～0.84 cm，外径0.90～1.00 cm，长9.5～10.5cm；滤膜：阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，0.2μm 或0.45μm 亲水聚苯醚砜滤膜。