[发明专利]保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置及方法。

背景技术

单链DNA结合蛋白(single strand DNA-binding proteins,SSBs)包括replication protein A(RPA)和端粒保护蛋白protection of telomeres protein 1(POT1)。当DNA复制的时候，双链DNA需要解旋成单链DNA并且与单链DNA结合蛋白结合来防止形成错误结构，维护端粒及基因组的稳定性。然而，已分化了的正常体细胞在非生理的化学、物理以及炎症因素干预下，细胞会从其生长的基质上脱离，其细胞核会产生剧烈的缩小，与此同时，与SSBs结合的染色质/DNA会受到这种缩小和拥挤的细胞核的压迫，从而产生适形变化,产生适形变化的SSBs会从单链DNA上脱离。将脱离结合状态的SSBs在保持细胞完整性的条件下，使其从细胞中分离出来，并且保持分离出的SSBs不会重新进入细胞，至今没有这样的装置。

众所周知，DNA是生物体遗传密码-基因的载体，基因组的稳定性对生物体的生物学行为是至关重要的。基因组的不稳定性或基因的变异与人类众多疾病密切相关，如癌症、衰老等等。而SSBs存在于一切真核生物细胞，SSBs的结合状态对保证DNA的正确复制、DNA的损伤修复以及基因组的稳定性具有关键性的作用。然而目前未发现有关技术手段和实验方法能够实现对结构完整且保持其应力平衡的细胞核内部的SSBs结合状态进行检测的文献报道。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置及方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置，包括：细胞电泳槽：该槽为内径0.76～0.84cm(优选0.8cm)、外径0.90～1.00cm(优选0.95cm)、长度18.9～17.1cm(优选18cm)的聚苯乙烯圆管，管壁中部，沿其纵轴方向开有一8.55×0.57cm～9.45×0.63cm(优选9×0.6cm)的矩形槽口；电泳缓冲液池：阳极、阴极各有一个，尺寸相同，9.5×3.33×4.75cm～10.5×3.68×5.25cm(优选10×3.5×5cm)；材质：聚苯乙烯；侧连接通道：阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，内径0.76～0.84cm(优选0.8cm)，外径0.90～1.00cm(优选0.95cm)，长9.5～10.5cm(优选10cm)的硅胶管；滤膜：阳极与阴极侧各有一个，尺寸相同，0.45μm或0.2μm亲水聚苯醚砜(Hydrophilic polyethersulfone)滤膜；电极：阳极与阴极各有一根，5.7～6.3cm(优选6cm)长，直径0.475～0.525cm(优选0.5mm)电泳仪用铂丝。

细胞原位电泳(cell in situ electrophoresis,CISE)，是将待检细胞制备成单细胞悬液，使其单个游离的细胞分散于等渗即应力平衡的介质中，在电场作用下，将细胞中的物质从细胞中分离出来的一种电泳方式。

上述保持细胞应力平衡条件下检测SSBs结合状态的装置，为水平式电泳装置。

利用上述装置检测SSBs结合状态的方法，具体包括以下步骤：

细胞预固定：分离处理生长期细胞，加入磷酸盐缓冲液(PBS)制成细胞悬液，将上述细胞悬液涂布于培养皿底部，将上述培养皿置于0℃条件下用UV灯照射(优选254nm UV灯以1.84W/cm²强度照射，总剂量165.6J/cm²)后，用磷酸盐缓冲液(PBS)收集培养皿中的细胞，离心(260g离心5min)弃上清液后加入4％多聚甲醛预固定1-6(优选3)sec；

预固定的目的为：既有应力结构以及细胞内待检蛋白非变性的状态下，经受细胞原位电泳过程，而不发生破碎，以保持细胞完整性，以方便接下来的打孔。

细胞打孔：将上述预固定的细胞，加入打空剂，所述打空剂能够使细胞膜和细胞核都打孔，优选聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，浓度为0.2％，细胞打孔时间5-15(优选10)min；

打孔的目的为：溶解细胞生物膜上的脂质，使单链DNA结合蛋白能够从细胞中移出，以方便脱落的单链结合蛋白从细胞中移出，不破坏细胞的整体结构。