[发明专利]一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒

权利要求书

1.一种能够同时鉴定区分新葵19号父本、母本和杂交种的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒包括油葵SSR标记， PCR扩增反应各组分的优化组合和扩增试剂盒，以及扩增条带的显色程序；以商品油葵品种新葵19号及其双亲的DNA为模板，进行大量SSR引物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的引物标记399和425，具体阐述如下：

（1）油葵DNA快速提取试剂盒A配置：50mmol/L Tris-HCl pH8,0.7 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA, pH8，1% CTAB，20mmol/L 2-巯基乙醇；

（2）PCR扩增反应试剂盒B配置：5×反应缓冲液4ul，25mmol/L MgCl₂溶液2ul，0.1mmol/L dNTPs溶液3ul,1umol/L Primer溶液3ul，SSR引物标记399和425,5u Taq DNA聚合酶0.2ul；

1-5ng模板DNA；反应总体积为20ul,扩增程序为95℃变性2min，94℃变性45ｓ、57℃退火45ｓ、72℃延伸60ｓ，共30个循环；72℃延伸8min；

引物标记399：

左序列CGTACGGTGTAGTTCTCATGGT；

右序列GGATCACGTGGCGTTCTATT）；

引物标记425：

左序列CAAAATACCCAGGTCAAAGCA；

右序列CCTAGCTTATGGGACGTATGGA；

加样缓冲液配试剂盒C配置：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml。

2.一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的方法，其特征在于，具体鉴定方法步骤如下：

（1）油葵DNA快速提取试剂含50mmol/L Tris-HCl pH8,0.7 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA, pH8，1% CTAB，20mmol/L 2-巯基乙醇；

（2）PCR扩增反应试剂含5×反应缓冲液4ul，25mmol/L MgCl₂溶液2ul，0.1mmol/L dNTPs溶液3ul,1umol/L Primer溶液3ul（SSR引物标记399和425）,5u Taq DNA聚合酶0.2ul, 1-5ng模板DNA；反应总体积为20ul,扩增程序为95℃变性2min，94℃变性45ｓ、57℃退火45ｓ、72℃延伸60ｓ，共30个循环；72℃延伸8min；

（3）胶板的制备：扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度10%，待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；电泳缓冲液为1×TBE，使电泳缓冲液液面刚高出凝胶面,恒压电泳；

（4）电泳、观察和拍照：取4ml上述步骤(2)PCR扩增反应液加样缓冲液1ml，含如下成分：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml；加样后的凝胶板立即通电进行电泳，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；电泳完毕，取出凝胶；凝胶用蒸馏水稍冲洗后，按照以下程序进行银染：固定采用10%乙醇、0.5%冰乙酸20min；银染采用0.2%硝酸银水溶液12min；蒸馏水漂洗两次；0.002%(w/v)硫代硫酸钠的水溶液漂洗；1.5%氢氧化钠、0.4%甲醛显色适度；在白色灯下DNA存在处显示出肉眼可辨的条带，于凝胶成像系统中拍照并保存之；

（5）上述步骤以商品油葵品种新葵19号及其双亲的DNA为模板，进行了约100对SSR物分子标记的筛选和重复，获得了鉴定出能够同时区分父本、母本和杂交种的SSR引物标记399和425。