[发明专利]羰基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用

权利要求书

1.一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126的羰基还原酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述羰基还原酶基因编码的重组羰基还原酶。

3.如权利要求2所述的重组羰基还原酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

4.一种权利要求1所述羰基还原酶基因构建的重组载体。

5.一种权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.一种权利要求1所述的羰基还原酶基因在制备重组羰基还原酶中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述羰基还原酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组羰基还原酶的菌体细胞。

8.一种权利要求2所述重组羰基还原酶在制备药物手性中间体中的应用，其特征在于所述应用为：以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6～10的缓冲液中，加入底物，辅助底物和NAD(P)⁺，在20～40℃、50～250rpm条件下反应，反应完全后，获得含药物手性中间体的混合液；所述底物为2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的一种；所述辅助底物为葡萄糖、甲酸铵、异丙醇或无水乙醇，所述辅助底物为葡萄糖时，添加葡萄糖脱氢酶构成辅助底物体系，所述辅助底物为甲酸铵时，添加甲酸脱氢酶构成辅助底物体系；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为20-200g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为10-100mmol/L缓冲液，所述辅助底物的用量为10-200g/L缓冲液，所述葡萄糖脱脱氢酶或甲酸铵脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶的菌体经发酵培养获得的湿菌体重量计，为20-200g/L缓冲液，所述NAD(P)⁺的用量为0.01-5mmol/L缓冲液。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含有重组羰基还原酶基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心5min，弃去上清液，收集湿菌体。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的反应以含重组羰基还原酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，于pH值为6～10的缓冲液中，加入底物，葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和NAD(P)⁺，在30℃、150rpm条件下反应，反应完全后，获得含药物手性中间体的混合液；所述底物为2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯、N,N-双甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)丙酰胺、4-氯乙酰乙酸乙酯和(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的一种；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为50g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为20mmol/L缓冲液，所述辅助底物的用量为50g/L缓冲液，所述葡萄糖脱脱氢酶的用量以含葡萄糖脱氢酶的菌体经发酵培养获得的湿菌体重量计，为50g/L缓冲液，所述NAD(P)⁺的用量为2mmol/L缓冲液。