[发明专利]羰基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种来源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126的羰基还原酶基因、编码酶、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌以及在制备手性药物中间体中的应用。

(二)背景技术

羰基还原酶(E.C.1.1.1.184)属于氧化环氧酶家族，反应需要辅酶NAD(P)H参与，能立体选择性催化潜手性的酮类物质不对称还原成光学手性醇中间体。该类酶广泛分布于自然界中，在各类动物、微生物和植物中均有发现。其中，由于微生物种类繁多、分布广，是羰基还原酶的主要来源。目前已从多种微生物中发现了羰基还原酶，如：Pichia finlandica，Clostridium ljungdahlii，Vibrio vulnificus，Candida glabrata，Serratia quinivorans，Polygonum minus，Arabidopsis thaliana，Oenococcus oeni，Serratia marcescens，Chryseobacterium sp.，Rhodococcus erythropolis，Candida magnoliae，Lactobacillus jensenii和Lactobacillus coryniformis等。此外，还从极端微生物中发现了嗜极端环境的羰基还原酶，如：Thermococcus sibiricus，Thermococcus guaymasensis，Haloferax volcanii，Thermus thermophilus，Sulfolobus acidocaldarius，Carboxydothermus hydrogenoformans，Thermococcus kodakarensis，Thermotoga maritime，Koliella Antarctica，Pyrobaculum calidifontis和Halobacterium sp.等。

近年来，随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的迅速发展，利用基因挖掘技术克隆新型羰基还原酶已成为一种重要手段。目前已利用此技术克隆了大量的羰基还原酶。其中部分羰基还原酶的基因已在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母等)中表达，获得产酶活力和选择性较高的基因工程菌，并应用于不对称还原羰基类化合物。尽管如此，许多羰基还原酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最适生物催化剂，因此大大限制了其应用范围。此外，许多酶的催化效率较低，也限制了其工业化应用。筛选具有较宽底物谱的新型羰基还原酶，研究其可以高效高选择性催化的手性药物中间体，不仅可以拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。

(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯是合成培南类药物中间体4-乙酰氧基氮杂环丁酮(4AA)的关键手性中间体。目前获得(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中间体的主要途径是以手性催化剂(R)-BINAP-Ru不对称催化2-苯甲酰氨甲基-3-酮丁酸酯生成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯。但由于其反应条件苛刻，不利于其工业化生产。生物催化法合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯报道较少，并且多数形成混合构型的产物。Saccharomycopsis malanga NBRC 171096催化生成(2S,3R)单一构型，并具有较高的对映选择性(对映体过量值ee>96.2％)与非对映选择性(非对映体过量值de>92.2％)，但是催化效率低(产率仅4％)。美国专利US20130034895研究了来源于Lactobacillus kefir的羰基还原酶催化合成(2S,3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯，具有较高的对映选择性(ee为60-99％)，但未见其非对映选择性的报道。