[发明专利]一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术的基因工程领域，特别是一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法。

背景技术

本发明涉及生物技术的基因工程领域，特别是一种基于 “睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法。

背景技术

转座子（transposon）又称为跳跃基因，是一种可在基因组内插入和切离并能改变自身位置的DNA序列。“睡美人”（Sleeping Beauty，SB）是现在公认应用最为广泛的转座子系统之一。近十五年大量的研究表明，“睡美人”不仅能在体外培养的鱼、小鼠和人等大多数脊椎动物的细胞中起作用，而且其介导的转基因能够稳定整合和长期表达，甚至整合的“睡美人”还能通过生殖细胞传递给后代，在后代中继续发挥作用。与其他转座系统的效率相比，“睡美人”在脊椎动物中的转座效率最高，且体内的转染效率要比体外高。

 一般用于基因转移和表达的“睡美人”系统包含带有T元件的转座子（transposon）和介导其转座的转座酶（transposase）两部分。本发明选用SB11转座酶，此酶在已初具转座酶活性的SB10基础上对其4个位点进行定点突变，活性比SB10提高了约3倍。pT转座子包含由两端带有32bp的反向重复序列（IR）及同向重复序列（DR）组成的末端反向重复序列（inverted terminal repeats，ITRS），ITRS的两个DR均可以和转座酶相结合，与细胞内的一种高度保守蛋白―高迁移率族蛋白（high mobility group，HMG）HMGB1结合形成突起复合物。转座酶催化释放转座子序列，并使其特异性地整合到基因组中的TA双核苷酸位点。转座子pT/HB从载体图谱可见，在多克隆位点（MCS）两端含有极为重要的IR/DR序列。但其中缺少能够启动插入基因表达的启动子，这也许会造成载体上目的基因的过低表达甚至不表达。

人类巨细胞病毒（CMV）启动子属于组成型启动子，它包含了三部分：CMV基因，IE1/IE2增强子，以及在IE94基因上游存在的一个强启动子，是上游调节区复合体的主要部分。IE1和IE2蛋白的表达受增强子的调控，可立即早期启动上游序列。因此CMV启动子被认为是启动真核基因表达最有力的启动子。其又因集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，并且在多种类型细胞的影响条件下均有活性。所以通常被用于构建高效真核表达载体，广泛应用于在基因工程及基因治疗领域。

绿色荧光蛋白（Green Fluorecence Protein，GFP）由238个氨基酸构成，自身就是一个生物发光系统，附带有激发后能发射生物荧光的发光色基，无需荧光素酶的参与。增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorecence Protein，EGFP）经野生型绿色荧光蛋白突变，产生双氨基酸取代而成，其荧光比野生型强35倍，具有结构稳定，表达高效，无种系依赖性等特点。带有EGFP基因的载体不仅适用于细胞基因表达、蛋白定位检测和细胞示踪标记，更能以融合蛋白的形式直观有效的检测表达载体目的基因的表达水平。因此，可将增强型绿色荧光蛋白作为一种良好的细胞指示剂，进行体外或体内实验研究。

外源基因进入宿主细胞的主要四种方法是：电穿孔法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。由于电穿孔法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒介导的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响，所以现在普遍采用的是脂质体法转染细胞。利用脂质体介导法关键要素就是防止其毒性的产生对细胞的影响，因此脂质体与质粒的比例，质粒总量，多质粒系统内各质粒比份量，以及细胞密度，转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题。

对于所有转染而言，可能是因为细胞间膜结构的差异，悬浮细胞的转染效率较贴壁细胞要低得多，由于细胞分裂状态差异原代细胞更难于前两者。原代细胞的转染一般需要价格非常昂贵的专用试剂盒进行转染，且转染效率也不甚理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于“睡美人”转座子系统制作高效转染各类细胞的方法，构建一个含有可利用CMV启动的EGFP荧光表达转座子系统，并通过我们所优化获得的转染条件能高效稳定的转染各种细胞系。

具体技术方案：

一种基于 “睡美人”（Sleeping Beauty）转座子系统制作高效转染各类细胞的方法：