[发明专利]冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种冷冻保存诱导多能干细胞的方法，其特征在于，

所述方法采用一种用于冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒进行，所述试剂盒包括：

第一冷冻工作液，所述第一冷冻工作液含有第一诱导多能干细胞培养基、乙二醇以及二甲基亚砜；以及

第二冷冻工作液，其中，所述第二冷冻工作液含有第二诱导多能干细胞培养基、乙二醇、DMSO和蔗糖，

其中，在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，并且在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量是在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量中的两倍，

进一步包括：

第一解冻液，所述第一解冻液含有第三诱导多能干细胞培养基和蔗糖；以及

第二解冻液，所述第二解冻液含有第四诱导多能干细胞培养基和蔗糖，

其中，

在所述第一解冻液中蔗糖的浓度是在所述第二解冻液中蔗糖的浓度的两倍，

所述第一至第四诱导多能干细胞培养基分别独立地为选自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培养基中的任意一种，

在所述第一冷冻工作液中，乙二醇的含量为10体积％，二甲基亚砜的含量为10体积％，剩余为所述第一诱导多能干细胞培养基；以及

在所述第二冷冻工作液中，乙二醇的含量为20体积％，二甲基亚砜的含量为20体积％，蔗糖的含量为0.3M，剩余为所述第二诱导多能干细胞培养基，

在所述第一解冻液中，蔗糖的含量为0.2M，其余为所述第三诱导多能干细胞培养基；以及

在所述第二解冻液中，蔗糖的含量为0.1M，其余为所述第四诱导多能干细胞培养基，

进一步包括：

封闭式玻璃化冷冻组件，

所述方法包括：

(1)将选自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培养基中的任意一种、第一冷冻液和第二冷冻液各0.5ml分别加入到四孔板的三个孔中；

(2)将所述四孔板在37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中静置以便平衡至少1小时；

(3)将待保存的诱导多能干细胞加入到所述四孔板中含有选自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培养基中的任意一种的孔中，放置1分钟；

(4)将所述待保存的诱导多能干细胞从所述含有选自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培养基中的任意一种的孔中转移至所述四孔板中含有所述第一冷冻液的孔中放置1分钟，同时利用第二冷冻液制作体积为20微升的液滴；

(5)将所述待保存的诱导多能干细胞从所述含有第一冷冻液的孔中转移至所述四孔板中含有所述第二冷冻液的孔中放置25秒后，将所述待保存的诱导多能干细胞转移至所述体积为20微升的液滴，以便得到含有诱导多能干细胞的液滴；

(6)将所述含有诱导多能干细胞的液滴装载于封闭式冷冻环上，并将所述封闭式冷冻环接触预先经过冷却的金属块表面，在所述液滴凝固后装入塑料套管中，封口后放置于液氮中进行保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金属块被预先冷却至-196摄氏度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金属块被液氮预先冷却至-196摄氏度。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括通过下列步骤复苏所述诱导多能干细胞：

(1)将选自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培养基中的任意一种、第一解冻液和第二解冻液各0.5ml分别加入到四孔板的四个孔中，以便得到含有第一解冻液的第一孔，含有第二解冻液的第二孔，含有选自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培养基中的任意一种的第三孔，以及含有选自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培养基中的任意一种的第四孔；

(2)将所述四孔板在37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中静置以便平衡至少1小时；

(3)将携带待复苏的诱导多能干细胞的冷冻环浸入到所述第一孔中，放置1分钟；

(4)将所述待复苏的诱导多能干细胞从所述第一孔转移至所述第二孔中，放置1分钟；

(5)将所述待复苏的诱导多能干细胞从所述第二孔转移至所述第三孔中，放置5分钟；以及

(6)将所述待复苏的诱导多能干细胞从所述第三孔转移至所述第四孔中，放置5分钟；

(7)将所述待复苏的诱导多能干细胞从所述第四孔中接种于培养皿中，在37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中培养过夜，以便复苏所述诱导多能干细胞，

其中，所述培养皿预先进行下列处理：

在OC培养皿中加入0.1重量％的明胶溶液0.5毫升，并在37摄氏度下放置30分钟，以便使明胶均匀包被所述培养皿的底部；

移除所述培养皿中的明胶溶液，并在所述培养皿中加入人包皮成纤维细胞细胞悬浮液，其中，所述人包皮成纤维细胞悬浮液的浓度为0.4×10⁵个细胞/毫升；

将所述培养皿置于37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中进行培养；

待人包皮成纤维细胞贴壁后，向所述培养皿中加入浓度为10μg/ml的丝裂霉素C溶液1ml，置于所述培养箱内3小时灭活处理人包皮成纤维细胞；以及

移除所述丝裂霉素C溶液，并用无钙离子的PBS溶液1ml将所述培养皿洗涤两次后，加入人包皮成纤维细胞培养基1ml，

其中在接种所述待复苏的诱导多能干细胞之前，移除所述培养皿中的人包皮成纤维细胞培养基，加入1ml选自mTeSR^TM1、mTeSR^TM2和E8培养基中的任意一种，在所述培养箱中平衡至少1小时后进行所述接种。