[发明专利]冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒和方法，其中该试剂盒包括：第一冷冻工作液，所述第一冷冻工作液含有第一诱导多能干细胞培养基、乙二醇以及二甲基亚砜；以及第二冷冻工作液，其中，所述第二冷冻工作液含有第二诱导多能干细胞培养基、乙二醇、DMSO和蔗糖，其中，在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，并且在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量是在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量中的两倍。利用该试剂盒冻存iPSC安全有效，解冻后iPSC复苏率高，多次培养传代能维持正常的核型，保持其特性。

技术领域

本发明涉及冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒及方法。

背景技术

2006年，Yamanaka等人应用重编程技术将小鼠成纤维细胞诱导为多能干细胞，也被称为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)。相对于胚胎干细胞，iPSC由体细胞直接进入多能干细胞的状态，避免了伦理学争议；另外，iPSC的发现使研究者能得到不同病人特定基因类型的多种细胞来源的干细胞，应用其进行临床治疗可减少免疫排斥反应。因此iPSC在毒理学、药理学、组织工程学以及再生医学等领域备受关注。但是iPSC广泛应用于临床还面临许多问题，其中安全性是首要问题，即要求iPSC的建系、培养、诱导分化、冷冻等过程无异源性成分。在细胞冷冻保存领域，许多研究致力于探索iPSC的无异源性冷冻方案，建立安全有效标准化并适用于临床的冷冻保存方案。

然而，目前的细胞尤其是诱导多能干细胞的冷冻保存方法仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

用于细胞冷冻保存的常用方法包括慢冻法和玻璃化两种。慢冻法是一种较经典的冷冻方法，但因其低复苏率和高分化率，应用于iPSC的冷冻有一定的局限性。玻璃化冷冻通过高张力的玻璃化液和较快的降温速率使溶液中的水不能形成晶体，而形成玻璃体，冷冻复苏率效率相对较高，用来作为冷冻保存iPSC的方法被越来越广泛地接受。但是由于玻璃化冷冻iPSC过程中一般采用开放式麦管，其中细胞与液氮直接接触，存在污染风险，不符合临床应用要求。

即目前iPSC的冷冻保存还没有非常高效安全的标准化冷冻方案。本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有安全高效的诱导多能干细胞冷冻保存方案。

进而，发明人应用HFF作为饲养层细胞，以商品化的化学成分明确的mTeSR^TM1、mTeSR^TM2或E8培养基为iPSC培养基，商品化的玻璃化封闭式冷冻装置为冷冻载体，封闭式玻璃化法冷冻保存iPSC，通过对解冻后的iPSC生长与分化情况进行比较，寻找并最终建立了一种安全高效的人诱导多能干细胞的冷冻保存方案。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于冷冻保存诱导多能干细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一冷冻工作液，所述第一冷冻工作液含有第一诱导多能干细胞培养基、乙二醇以及二甲基亚砜；以及第二冷冻工作液，其中，所述第二冷冻工作液含有第二诱导多能干细胞培养基、乙二醇、DMSO和蔗糖，其中，在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量与所述二甲基亚砜的体积含量相同，并且在所述第二冷冻工作液中乙二醇的体积含量是在所述第一冷冻工作液中乙二醇的体积含量中的两倍。

发明人惊奇地发现，利用本发明的试剂盒冻存诱导多能干细胞，细胞不会与液氮直接接触，污染风险小，安全有效，符合临床应用要求，并且经冻存的诱导多能干细胞，分化率低，解冻后复苏率高，多次培养传代能维持正常的核型，保持其特性。