[发明专利]一种微流控多色荧光细胞计数仪

说明书

技术领域

本发明属于流式细胞检测领域，特别涉及一种基于微流控芯片的多色荧光细胞计数仪。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTCs)是指从原位瘤脱离出来并进入血液循环的细胞，这些细胞具有在机体内其它部位附着并形成新的癌转移灶的潜能。CTC在多种癌症患者体内都有发现，其具有原发灶细胞的生物学特征，可在机体浅表的外周血中检出，被认为在反映癌症恶性程度及预后方面具有重要的应用价值，其数量的统计有可能成为判断癌症转移、复发、预后的重要指标。因此，如何高效、快速、准确的对获取的CTCs进行计数分析已成为基于循环肿瘤细胞为主的癌症诊断系统研发和应用的关键问题之一。

一般获取CTC的方法是使用免疫磁球对血液中的CTC进行捕获，磁分离后，对捕获的循环肿瘤细胞进行标记分析。其基本原理是使用特异性的荧光染料对目标细胞进行标记，利用荧光显微镜中的荧光激发光源进行激发，检测荧光标记后静态或动态细胞的荧光信号，并进行统计分析。一般的荧光细胞计数仪能自动检测和计数循环肿瘤细胞，虽然这些仪器已具有强大功能，但其也存在一些需要改进的地方。首先，仪器中的荧光计数装置的相关设备需要与CTCs磁分离捕获装置配合使用，这无疑增加了仪器本身及相应组件的成本，使其较难普及应用；第二，捕获CTC的免疫磁球仅采用单一的抗EpCAM抗体修饰，免疫磁球的单一性严重影响了其对复杂的肿瘤细胞的捕获效率。第三，仪器中的荧光计数装置需要通过人工计数荧光染色的细胞个数，人工计数不但增加了样品分析的时间，且在一定程度上降低了计数的稳定性和一致性。因此，市场及临床迫切需要一种价格低廉，具有自主研发优势，并且可以很好的灵活应用于普通消费群体的CTCs荧光分析及评判装置。

微流控芯片技术是20世纪90年代发展起来的学科，是指操作微小网络通道(5-500微米)中流体的科学技术。微流控芯片是基于大规模平行处理生物信息分子原理的微型装置，可传输微升(μL)到纳升(nL)甚至皮升(pL)量级的流体，并将生化反应的若干步骤包括分析、洗涤、检测等集成在一块或几块微流体芯片上，具有信息通量大、自动化、系统化的特点。微流控芯片具有可集成化、易自动化操作的特点使其与常规生物分析相比有很多潜在的优势，在生物医学分析领域有着越来越多的应用。目前以微流控芯片为基础的仪器例如PCR，蛋白结晶仪，DNA测试仪都已经相继问世。

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题提供一种荧光标记后循环肿瘤细胞的快速准确计数的仪器，填补结合微流控芯片技术和免疫细胞化学技术，进行准确的循环肿瘤细胞检测和分析的技术空白。

技术方案

本发明提供的技术方案之一为一种微流控多色荧光细胞计数仪，包括微流控芯片系统、荧光光源系统和分析计数系统；所述的微流控芯片系统包括微流控芯片、计算机控制的控制器和管道；所述的荧光光源系统包括两种或以上激光器，如激光器A和激光器B、荧光探测的物镜、和信号处理的摄像机；所述的分析计数系统包含计算机。

上述的技术方案的优选方式之一为，所述的微流控芯片系统还可选地含有、载物台、电机、导轨和丝杆之一或以上。

上述的技术方案的优选方式之二为，所述的荧光成像系统还可选地含有照明光源、聚光镜、物镜、扩束镜A、二向色镜1、扩束镜B、二向色镜2、滤光片转轮之一或以上。

上述的技术方案的优选方式之三为，所述的物镜优选40倍光学物镜，所述的激光器A优选405nm，所述的激光器B优选488nm。

上述的技术方案的优选方式之四为，所述的微流控芯片的材质为硅酮；具有三维结构；芯片厚度小于50微米；芯片内样品容量小于10微升；芯片表面采用EpCAM抗体修饰。

上述的技术方案的优选方式之五为，所述的荧光光源系统设两种荧光激发光源；所述激光器(A)荧光激发光源激发被4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的细胞，产生蓝色荧光；所述激光器(B)荧光激发光源激发被异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)染色的细胞，分别产生绿色荧光和红光荧光。

本发明提供的技术方案之二为一种微流控多色荧光细胞计数仪的制备方法，包括以如下步骤制备微流控芯片，

1)旋涂光刻胶于硅片表面，固化，紫外曝光后显影，制作微流控芯片模板；

2)硅酮(PDMS)按A:B为5:1混合，在真空中脱气，倒入置有模具的培养皿中，倒胶厚度5毫米，80℃加热固化60min后将PDMS与模具分离；

3)打孔，将上下两层PDMS对准，粘合；80℃烘烤1小时。