[发明专利]利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法

权利要求书

1.一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）、分子克隆，选择pET-28a(+)为目标蛋白的载体，并且在His标签前段加入GST融合蛋白，以EcoRI和NotI为限制性酶切位点设计引物进行PCR实验扩增目的基因：

上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG

下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC

取一定量的上述PCR体系将扩增目的基因，利用琼脂糖凝胶电泳取鉴定PCR产物，如果出现500bp的条带则可以证明PCR得到了目标产物，可以进行下一步的胶回收和双酶切实验；

（2）、融合蛋白，将胶回收后的PCR扩增产物与已连入GST蛋白序列的pET-28a空载体分别进行双酶切反应，然后将双酶切得到的具有粘性末端的PCR产物和线性pET-28a载体利用T4连接酶进行过夜连接，再将得到的的重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行质粒的扩增，提取DH5α中的重组质粒备用；

（3）、蛋白表达，在重组质粒转化入E.coliROSETTA菌株中后，进行小量蛋白的试表达，试表达成功后对转化入E.coliROSETTA菌株中的重组质粒进行大量表达得到切割蛋白酶；

（4）、蛋白纯化，将大量表达后的切割蛋白酶进行IMAC和肝素阳离子交换层析实验对其进行纯化；

（5）、酶活测定，经过步骤（4）的纯化后，得到得到20℃，常压条件下适宜的切割蛋白酶，切割蛋白酶的酶活缓冲液为10mMMES，PH6.7，酶活缓冲液的蛋白体系终浓度15μM，底物体系终浓度为0.04mM。

2.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（1）中一定量的上述PCR体系将扩增目的基因的具体量为过50μL。

3.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（2）中在DH5a中提出重组质粒后，还要通过双酶切验证，确定之前的链接反应是否正确。

4.根据权利要求1所述的利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（5）中通过酶活缓冲液最终得到的FRET酶活体系见下表：

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5.根据权利要求4所述的利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，其特征在于，所述K_m为测定初速度与浓度的非线性拟合曲线。