[发明专利]利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法

说明书

本发明涉及蛋白酶重组纯化技术应用领域，特别是一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法。

背景技术

目前，在蛋白切割方面普遍采用PPase或者thrombin两种酶，然而这两种酶都是单重标签，其选择性和实用性比较单一；为了克服上述缺点，技术人员重组了切割蛋白酶，这种切割蛋白酶具有双重标签，其选择性和实用性较强，但是在重组、表达和纯化方法上还是不成熟，存在着生产效率低、生产周期长的缺点。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法。

实现上述目的本发明的技术方案为，一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，该方法包括如下步骤：

（1）、分子克隆，选择pET-28a(+)为目标蛋白的载体，并且在His标签前段加入GST融合蛋白，以EcoRI和NotI为限制性酶切位点设计引物进行PCR实验扩增目的基因：

上游引物：TTGGATCCCATATGGGCCCGAGCCTTGACTTTG

下游引物：AGTGCGGCCGCTTATTGTTCACTAGCAAAGTAAC

取一定量的上述PCR体系将扩增目的基因，利用琼脂糖凝胶电泳取鉴定PCR产物，如果出现500bp的条带则可以证明PCR得到了目标产物，可以进行下一步的胶回收和双酶切实验；

（2）、融合蛋白，将胶回收后的PCR扩增产物与已连入GST蛋白序列的pET-28a空载体分别进行双酶切反应，然后将双酶切得到的具有粘性末端的PCR产物和线性pET-28a载体利用T4连接酶进行过夜连接，再将得到的的重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行质粒的扩增，提取DH5α中的重组质粒备用；

（3）、蛋白表达，在重组质粒转化入E.coliROSETTA菌株中后，进行小量蛋白的试表达，可选取重组蛋白5mLDotblot进行试表达。，试表达成功后对转化入E.coliROSETTA菌株中的重组质粒进行大量表达得到切割蛋白酶；

（4）、蛋白纯化，将大量表达后的切割蛋白酶进行IMAC和肝素阳离子交换层析实验对其进行纯化；

（5）、酶活测定，经过步骤（4）的纯化后，得到得到20℃，常压条件下适宜的切割蛋白酶，切割蛋白酶的酶活缓冲液为10mMMES，PH6.7，酶活缓冲液的蛋白体系终浓度15μM，底物体系终浓度为0.04mM。

所述步骤（1）中一定量的上述PCR体系将扩增目的基因的具体量为过50μL。

所述步骤（2）中在DH5a中提出重组质粒后，还要通过双酶切验证，确定之前的链接反应是否正确。

所述步骤（5）中通过酶活缓冲液最终得到的FRET酶活体系见下表：

所述K_m为测定初速度与浓度的非线性拟合曲线。

利用本发明的技术方案制作的切割蛋白酶，与PPase或者thrombin相比，其优势在于具有双重标签，这便使其在蛋白切割方面有了更多的选择性和实用性；并且切割蛋白酶在大肠杆菌中进行纯化表达，1L菌液可拿到20mg左右的蛋白，相较其他蛋白酶，具有效率高，周期短的优势。

附图说明

图1是本发明所述证明PCR得到了目标产物的示意图；

图2是本发明所述证明扩增后重组质粒的示意图；

图3是本发明所述重组质粒双酶切鉴定的示意图；

图中，泳道1为37℃，酶切15min的状态；M为maker；

图4是本发明所述小量蛋白（5mLDotblot）试表达的示意图；

图中，1,37℃表达30min；2，37℃表达2h；3，菌株用IPTG诱导前；4，阴性对照，菌株转入空载pET-28a(+)质粒；

图5是本发明所述FPLC以及蛋白纯化结果蛋白胶图；

图6是本发明所述K_m曲线示意图；

图7是本发明所述证明切割蛋白酶具有GST和HIS双重标签的曲线图；

图8是本发明所述切割蛋白酶在底物选择上的对比图；

图9是本发明所述切割蛋白酶与同类产品在切割效果上的对比图（圆点代表本产品、方框代表PPase酶、三角代表TEV酶）；

图10本发明所述的切割蛋白酶在不同酶活体系中的活性对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体描述，一种利用大肠杆菌纯化和提高切割蛋白酶活性的方法，该方法包括如下步骤：