[发明专利]酪氨酸类似物翻译系统和基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族

说明书

本发明涉及蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族iLovU，其包括五种突变体蛋白，其分别通过在野生型黄素蛋白iLov 486位氨基酸位点特异性插入3‑氯代酪氨酸、3，5‑二氯代酪氨酸、3，5‑二氟代酪氨酸、2，3，5‑三氟代酪氨酸或2，3，5，6‑四氟代酪氨酸(这五种酪氨酸类似物作为光致电子转移探针)而得到。本发明还涉及两种氨酰基‑tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11或13所示。这两种氨酰基‑tRNA合成酶突变体能够分别在翻译的氨基酸序列中插入3，5‑二氯代酪氨酸或2，3，5，6‑四氟代酪氨酸。

技术领域

本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供两种酪氨酸类似物翻译系统和基因编码的蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白家族iLovU。更具体地，本发明通过基因编码的方法在黄素蛋白iLov中定点特异性插入五种酪氨酸类似物：3-氯代酪氨酸(ClY)、3，5-二氯代酪氨酸(Cl2Y)、3，5-二氟代酪氨酸(F2Y)、2，3，5-三氟代酪氨酸(F3Y)、2，3，5，6-四氟代酪氨酸(F4Y)(该五种酪氨酸类似物简称为ClnY/FnY)作为光致电子转移探针，得到的突变蛋白即为光致电子转移荧光传感器。本发明还涉及两种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：11和13所示。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3，5-二氯代酪氨酸/2，3，5，6-四氟代酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入3，5-二氯代酪氨酸/2，3，5，6-四氟代酪氨酸。

背景技术

基因编码和荧光蛋白(fluorescent protein，简称FP)传感器是生物学研究中的重要技术手段。在过去的几十年中，人们已经开发出多种荧光蛋白传感器，用于监测金属离子，pH值，第二信使和翻译后修饰(PTM)，这对于解开它们在体内信号转导网络中的作用是至关重要的。这些荧光蛋白传感器通常依赖于荧光共振能量转移(FRET)或者绿色荧光蛋白GFP荧光团酚基的质子化/去质子化来发挥作用。尽管它们现在已被广泛应用，但是在分析物结合前后，这些荧光蛋白传感器的荧光强度变化通常都在两倍以内。相比之下，光致电子转移(photo-induced electron transfer，简称PET)机制开始越来越广泛地被引用到荧光传感器设计中来，最重要的原因在于分析物结合前后，荧光蛋白传感器可以展现出显著的荧光强度变化(通常可以增强10至100倍)。

蛋白质光致电子转移荧光传感器蛋白的设计通常使用荧光发光体-连接体-接受体的分子结构形式。在配体结合之前，传感器处于关闭状态，光激发致使受体和荧光基团之间产生电子转移，削弱光能，最终导致荧光淬灭。而当配体结合之后，传感器转变为开启状态，受体分子由于配体的结合可以显著增加HOMO能量，阻断光致电子转移，从而使荧光基团发射光子，产生荧光。基于这种原理，科学家在光致电子转移荧光传感器的设计中通常选择一些相对简单的分析物来进行传感器的开启，如H⁺，Na⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺，Pd²⁺，Hg²⁺，F^-和神经元电压等。这些传感器现已广泛应用于临床，细胞生物学研究以及环境监测中。

为了开发基因编码的蛋白质光致电子转移传感器蛋白，我们首先需要在蛋白中遗传整合非天然氨基酸(UAAs)。本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。