[发明专利]一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法，属于植物病菌检测领域。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物之一。烟草角斑病(Pseudomonas syringae pv.angulata)是烟草主要的细菌性病害，在我国北方烟区发生严重，每年均造成一定程度的危害和经济损失。

传统细菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，工作繁琐，时间长，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法特异性较差，常常受到抗血清质量的影响，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。目前，我国官方机构进行细菌鉴定过程中主要采用传统的分类学鉴定以及生物学鉴定(16S rRNA序列测定分析)相结合的方式，鉴定时间至少需要1个月以上，对于农业生产过程中所面临的需要及时快速鉴定的病原菌，这些方法存在明显的不足。随着生物技术在病害鉴定方面开发应用及病菌DNA数据在基因库中的不断积累，使分子生物学方法鉴定细菌种类技术日趋完善和成熟。建立细菌的PCR特异鉴定引物，利用细菌分离培养技术及PCR技术，可以在(1-2)d内对初期侵染的细菌进行鉴定，从而指导烟农及时准确用药，对保障我国烟叶生产具有重要的意义。

对于烟草角斑病的分子鉴定方法，河南农业大学的蒋世君等2010年申请了中国专利CN 101206193“快速检测和鉴定烟草野火病菌和角斑病菌的方法”，该方法涉及的角斑病菌的PCR鉴定引物设计于hrpZ基因，且同时扩增出烟草野火病菌，也就是说不能有效区分野火病和角斑病或者其它丁香假单孢菌。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中烟草角斑病菌的生物学检测方法特异性差、灵敏度低、周期长、血清学鉴定方法成本高并易造成假阳性等问题，提供烟草角斑病菌特异分子鉴定引物以及可靠、特异性强、灵敏度高的烟草角斑病菌快速分子鉴定的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

基于烟草角斑病的AvrPphE基因区域设计合成了烟草角斑病菌特异的PCR鉴定引物，该引物可以特异鉴别烟草角斑病菌，烟草野火病菌、其它的丁香假单孢菌及烟草叶面分离的其它细菌分离物均扩增不出特异的条带。

具体地，一组烟草角斑病菌的分子鉴定引物，如下：

上游引物YF1：5'-GCCCAGAACCCCGCTTCTTA-3'(SEQ ID NO：1)

下游引物YR2：5'-GGGTCAGAACGTTCTCGGCG-3'(SEQ ID NO：2)

烟草角斑病菌AvrPphE基因序列如序列表中的SEQ ID NO：3所示，本发明所述引物对烟草角斑病菌特异性扩增出763bp的产物。

本发明还提供了一种烟草角斑病菌的鉴定方法，该方法包括如下步骤：

(1)烟草角斑病细菌分离培养

用灭菌的剪刀将烟草角斑病疑似病叶病斑(1-2)cm剪下。超净工作台中，用70％乙醇对病斑进行表面消毒(30s-60s)，灭菌水漂洗(3-4)次，置于LB固体培养基中25℃下培养2-3天，收集病斑周围长出的细菌菌落于无菌的1000mL的LB液体培养基中，混匀后，吸取100μL菌液涂LB固体平板，25℃下培养2-3天，挑取单菌落于100μL的LB液体培养基中，25℃下培养4h，用于PCR检测。也可以直接用灭菌牙签蘸取单菌落用于PCR检测。

(2)烟草角斑病菌PCR扩增

在0.5mL的PCR管中加入10×PCR缓冲液(Buffer)1.0μL，加入10pmol/μL的YF1和YR2引物各0.5μL，加入2.5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，加入dNTPs 1μL，加入细菌菌液(或用灭菌牙签蘸取的单菌落)1μL，加入超纯水5.8μL。PCR扩增程序见表1。

表1 菌液(落)PCR反应条件

(3)PCR扩增产物分离及结果判别

将4μL PCR扩增产物用1.5％琼脂糖电泳分离，于紫外分析仪中根据扩增产物的大小判定结果。如果能特异性地扩增出763bp产物时，即可判断所分离的细菌为烟草角斑病菌，否则所分离的细菌中未存在烟草角斑病菌。

本发明方法适用于植物组织中烟草角斑病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中烟草角斑病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：