[发明专利]一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗

权利要求书

1.一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于包括以下步骤：

1)对禽流感病毒进行复苏处理；

2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行梯度稀释，以各稀释度病毒液接种鸡胚，再取全部受感染鸡胚尿囊液中其HA效价排名处于前10％或前20％的尿囊液作为种子批；

3)将步骤2)得到的种子批分别接种鸡胚并传代6～10代，将各代次受感染鸡胚尿囊液中EID₅₀指标≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的种子批作为基础种子批；

4)将步骤3)得到的基础种子批接种鸡胚，增殖禽流感病毒。

2.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的复苏处理包括以下流程：取出冻存的禽流感病毒，进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5～37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传2～3代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病毒液。

3.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤2)具体包括以下流程：将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接种若干鸡胚，接种量为0.08～0.12mL，36.5～37.5℃孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价≥(1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1～2例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤3～5代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前10％或前20％的尿囊液作为种子批。

4.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤3)具体包括以下流程：将步骤2)得到的种子批进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5～37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传6～10代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的尿囊液作为基础种子批。

5.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤4)具体包括以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行10^-3-10^-6稀释，接种鸡胚，收获24～96h鸡胚尿囊液即为病毒液。

6.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒。

7.根据权利要求1所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤1)所述的禽流感病毒含量为10^-8.0EID₅₀/0.1mL～10^-8.5EID₅₀/0.1mL。

8.根据权利要求5所述的一种禽流感病毒增殖方法，其特征在于步骤4)具体包括以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行10^-4-10^-5稀释，接种鸡胚，收获65～75h鸡胚尿囊液即为病毒液。

9.一种禽流感疫苗，其特征在于由以下方法制备：

1)病毒的灭活：将利用权利要求1方法制备的禽流感病毒液用甲醛灭活，甲醛终浓度为1‰，20℃灭活20小时得到灭活毒液；

2)水相的制备：水相的制备：将灭活毒液以3500r/min离心20min，经8层纱布过滤，将过滤后的灭活毒液与吐温80以(22～26):1的比例混匀，即得到疫苗水相；

3)油相的制备：取白油佐剂95份、司班80 5份、硬脂酸铝2份混匀，即得到疫苗油相；

4)疫苗的乳化：取4份水相慢慢的加入到6份油相，以12000r/min转速剪切2-5min，即得到禽流感疫苗。

10.根据权利要求9所述的一种禽流感疫苗，其特征在于所述白油佐剂型号为Marcol52。