[发明专利]一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及兽用疫苗技术领域，具体涉及一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗。

背景技术

禽流感(Avian Influenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为Ⅰ类传染病。根据毒株致病性的不同，禽流感可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感两大类。H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，产蛋家禽感染后,可引起产蛋率下降，软壳蛋、无壳蛋增多，严重的将会停止产蛋。种禽感染后，除上述症状外，还表现出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雏禽出壳困难，出壳后的雏禽弱雏增多。雏禽在一周内死亡率较高，且易感染大肠杆菌，治疗较困难。H9亚型禽流感混合感染其他病原时，可导致发病率和死亡率的大幅度提高，给养殖业带来巨大损失。

疫苗接种是预防和控制流感病毒流行的最有效手段。目前，控制禽流感病毒发病的主要手段是接种灭活全病毒疫苗，其生产主要依靠鸡胚法实现。为了提高灭活疫苗的免疫原性，必须提高疫苗制备时抗原的含量，故如何提高病毒滴度成为关键环节。现在，提高流感病毒含量的方法主要通过浓缩的方法实现，这样将提高疫苗制备的成本，使疫苗制备过程复杂化，并且增加了病毒液的损失和污染风险。

发明内容

为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种禽流感病毒增殖方法及利用该方法制备的禽流感疫苗，旨在节约疫苗制备成本，提升生产效率。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种禽流感病毒增殖方法，包括以下步骤：

1)对禽流感病毒进行复苏处理；

2)将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行梯度稀释，以各稀释度病毒液接种鸡胚，再取全部受感染鸡胚尿囊液中其HA效价排名处于前10％或前20％的尿囊液作为种子批；

3)将步骤2)得到的种子批分别接种鸡胚并传代6～10代，将各代次受感染鸡胚尿囊液中EID₅₀指标≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的种子批作为基础种子批；

4)将步骤3)得到的基础种子批接种鸡胚，增殖禽流感病毒。

优选的，步骤1)所述的复苏处理包括以下流程：取出冻存的禽流感病毒，进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5～37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，传2～3代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液即为复苏处理完毕的病毒液。

优选的，步骤2)具体包括以下流程：将步骤1)复苏处理完毕的病毒液进行10倍系列稀释，分别取稀释度为10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11的病毒液接种鸡胚，每个稀释度接种若干鸡胚，接种量为0.08～0.12mL，36.5～37.5℃孵育，分别收集接种后24-96h死亡胚和96h未死鸡胚尿囊液，测定HA效价并以HA效价≥(1:256)认定为鸡胚已感染病毒，在已感染病毒的鸡胚尿囊液中选取由最大稀释倍数病毒液接种鸡胚得到的尿囊液1～2例作为后续传代用病毒液，以此重复上述稀释、筛选步骤3～5代，每代、每例尿囊液分别保存，将其中HA效价排名处于前10％或前20％的尿囊液作为种子批；

优选的，步骤3)具体包括以下流程：将步骤2)得到的种子批进行10^-3～10^-4稀释，接种10日龄SPF鸡胚，36.5～37.5℃培养，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再传6～10代，收获24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液从中筛选病毒含量≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的尿囊液作为基础种子批。

优选的，步骤4)具体包括以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行10^-3-10^-6稀释，接种鸡胚，收获24～96h鸡胚尿囊液即为病毒液；进一步的，可以优选为以下流程：将步骤3)得到的基础种子批进行10^-4-10^-5稀释，接种鸡胚，收获65～75h鸡胚尿囊液即为病毒液。

优选的，步骤1)所述的禽流感病毒为H9亚型禽流感病毒。