[发明专利]一种基因与药物共输送的PLGA超声纳米泡及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料制备领域，具体涉及一种基因与药物共输送的PLGA超声纳米泡及其制备方法和应用。

背景技术

超声成像由于具有实时无创、灵敏度高、价格低廉等优点被大量应用于疾病的临床诊断，成为现代医学成像的主要检测方法之一。超声造影剂的出现和不断发展大大增强了超声成像分辨率，提高了对比度。近年来研究表明超声造影剂不仅在分子成像、血栓治疗等方面具有很好的应用价值，同时在药物或基因体外靶向运输及定点释放方面也取得了较大成功，这提示我们可以通过结合超声造影剂的分子成像及药物或基因的靶向运输能力来建立一种新的肿瘤治疗方法。

临床常用的微泡级超声造影剂粒径大，不能跨越“内膜屏障”，且所携带的药物在血管内释放后仅有少量进入到肿瘤细胞内，导致许多血管外疾病的诊断受到限制。随着纳米技术的发展，超声造影剂从微米级已发展到了纳米级。研究表明，肿瘤组织生长迅速，血管新生快速，容易导致血管外膜细胞缺乏，而且肿瘤组织的淋巴回流不完善，因此纳米级造影剂能穿越血管内皮进入组织间隙进入并蓄积在肿瘤组织部位，从而实现血管外组织显像及诊断治疗。这就是肿瘤细胞的增强渗透与滞留效应(Enhanced permeation retention effect,EPR)。因此，通过改性使纳米级超声造影剂作为抗癌药物或基因的运输载体，不仅具有超声成像能力，还能定点靶向运输及释放出药物或基因，使其成为治疗诊断一体化的多功能造影剂，为肿瘤等重大疾病的早期诊断和治疗提供更可靠的信息。

发明内容

本发明的目的在于：①开发一种集超声成像、药物输送、基因治疗于一体的治疗诊断一体化的多功能纳米泡；②开发多功能纳米泡的制备方法；③以及这种多功能纳米泡在肿瘤诊断和治疗中的应用，即不仅能发挥其超声成像的能力，同时还能把药物和基因高效地运输到肿瘤部位协同发挥疗效作用。

本发明主要以可生物降解的PLGA(Poly(lactic-co-glycolid acid))作为载体材料，采用双乳化溶剂挥发法来制备PLGA超声纳米泡，其内部装载抗癌药物阿霉素(DOX)，并且在该纳米泡表面通过聚乙酰亚胺(PEI)的修饰，从而通过静电吸附作用连接上能逆转肿瘤细胞多药耐药MDR-1基因的shRNA质粒，通过控制该纳米泡的粒径大小200-500nm左右，使其能通过EPR效应被动靶向肿瘤部位。该纳米泡不仅能用于肿瘤的实质成像，同时在胞内酸性条件下首先释放出所携带的基因，在细胞内被切割成siRNA、沉默耐药基因MDR-1的表达，逆转肿瘤细胞耐药性，并释放出所携带的药物DOX去协同发挥疗效，达到高效、快速杀死肿瘤细胞的目的。

本发明还提供上述PLGA纳米泡的制备方法。其制备方法包括以下步骤：

(1)按质量比1:10-30的比例将PLGA完全溶解在CH₂Cl₂中，再加入药物溶液，超声乳化形成初乳液；再将初乳液导入PVA溶液中，超声乳化，形成复乳液；在该复乳液里逐滴加入异丙醇溶液，磁力搅拌数小时，待CH₂Cl₂挥发完全。收集沉淀物并洗涤三次，得到载药的纳米泡。

(2)上述药物溶液的加入量为总体积的1％-10％；PVA溶液的体积为初始体积的10-30倍；异丙醇的量为总体积的2％-10％。

(3)上述载药的PLGA纳米泡冷冻干燥成冻干粉低温保存。

(4)按5-10g/L的比例将上述冻干粉载药PLGA纳米泡溶于双蒸水中，加入EDC溶液反应1小时；再加入PEI溶液，置于恒温摇床反应1天；收集沉淀物，洗涤数次，冷冻干燥得到载药PLGA/PEI冻干粉，低温保存。

(5)上述EDC溶液的加入量为反应体积的10％-30％；PEI按纳米泡与PEI的质量比在20-100:1的量加入。

(6)将上述载药PLGA/PEI冻干粉按5-10g/L的比例溶解于双蒸水中，混合一定量的质粒DNA，室温反应1小时，得到携载基因和药物的PLGA纳米泡。

(7)上述质粒按纳米泡与质粒质量比10-120:1的比例加入反应体系。

(8)上述携载基因和药物的PLGA纳米泡冷冻干燥成冻干粉可长期低温保存。

本制备方法具有操作简单、条件温和，对设备要求低、没有污染等优点。该纳米泡保存时间长，便于在生物医学领域应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)合成的DOX-PLGA NBs具有很好的稳定性，适合长时间储存，有良好的载药量和包封率。