[发明专利]香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法

权利要求书

1.一种香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：步骤如下：首先设计锁式探针和其扩增引物，然后经过环化连接、消化反应，再用滚环扩增引物进行超分支滚环扩增；阳性菌琼脂凝胶电泳后，会出现典型的阶梯状的条带，从而达到检测的目的；

所述锁式探针和引物的核苷酸序列如下：

锁式探针：

Padlock-Prs2：5'-AACACACAGTTGCTCGCACTGGCCGAGTGGAACCGAGGAAATAGAGAACCCCATCCAGCACTTCCCTATGTCTCTCCCGTATGGTTTCTTGGCCAGCACCGATGG-3'；

滚环扩增引物如下：

PadR：5'-CCATCCAGCACTTCCCTATGTCT- 3'，；

PadF：5'-GGTTCTCTATTTCCTCGGTTCCAC- 3'。

2.根据权利要求1所述的香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：所述环化连接的反应体系为10μL：10×Taq DNA连接酶缓冲液1μL，40U/μL的Taq DNA连接酶0.15μL，500pmol/L锁式探针0.2μL，DNA模板2μL，Sterilized ddH₂O补足至10μL，采用热循环连接法连接：94℃ 4 min； 94℃30s，65℃5min，15个循环；95℃ 15min灭活Taq DNA连接酶，反应结束后立即将反应管冰浴5min。

3.根据权利要求1所述的香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：所述消化反应的条件如下：向冰浴后的反应管中加入10μL的混合液：10×核酸外切酶I缓冲液2μL；5U/μL的核酸外切酶I 1.5μL；10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2μL； 5U/μL的核酸外切酶Ⅲ 1 μL；Sterilized ddH₂O补足至10μL，37℃反应2 h，再于95℃反应3h。

4.根据权利要求1所述的香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：超分支滚环扩增反应体系为25μL：10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μL，8U/μL的 Bst DNA聚合酶0.5μL，10 μmol/L 的padR 0.5μL，10 μmol/L的padF 0.5 μL，10mmol/L的 dNTPs 1μL，环化连接消化后产物2μL，Sterilized ddH₂O 补足至25μL；反应条件：63 ℃反应1.5 h。

5.根据权利要求1所述的香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，其特征在于：凝胶成像分析：取7μL滚环扩增产物于2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，紫外凝胶成像系统照相分析。