[发明专利]香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种香蕉细菌性枯萎病菌检测方法，更具体涉及一种运用锁式探针对香蕉细菌性枯萎病菌进行滚环扩增的检测方法，属于农作物防病治病及出入境植物检疫范畴。

背景技术

香蕉细菌性枯萎病菌(Ralstonia solanacearum race 2, Rs2)是危害香蕉最严重的病原细菌，能导致香蕉植株发生严重的枯萎，最终导致植株死亡^[1,2]。根据寄主的不同，Ralstonia solanacearum可化分为5个races^[3]，而香蕉细菌性枯萎病菌属于race 2，主要侵害三倍体香蕉及赫蕉。香蕉细菌性枯萎病菌是我国禁止进境的检疫性有害生物，在我国没有分布，我国虽然对进境香蕉和香蕉种苗进行检疫，但对进境芭蕉属（Musa）和蝎尾蕉属（Heliconia）的景观类植物缺乏该细菌的检测，这些植物也可作为香蕉细菌性枯萎病菌寄主^[4]，携带并传入香蕉细菌性枯萎病菌存在一定的风险。

自锁式探针被报道以来^[5]，它以灵敏、特异、稳定等特点广泛接受，并越来越多地应用到分子检测中。锁式探针是由3′和5′端两段靶标序列和中间的一段对检测结果没有影响的连接序列构成的一种较长的单链寡核苷酸片段。其工作原理是当检测体系中存在靶标DNA时，锁式探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对, 线型锁式探针在连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应靶标DNA 存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在。在核酸外切酶的作用下，多余的线性锁式探针被消化水解，连接成环状的锁式探针在Bst DNA聚合酶和通用引物的作用下恒温扩增^[6]，其扩增效率在1h之内就可以达到10⁹或更多拷贝^[7]。锁式探针的恒温扩增具有极好的检测灵敏度、特异性和实用性，近几年已被广泛地应用于细胞原位检测、微生物、医学病原检测鉴定等领域。本研究旨在依据香蕉细菌性枯萎病菌独有的蛋白基因序列，设计特异的锁式探针及其扩增引物，建立特异、灵敏的香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增（HRCA）检测技术，为我国的口岸把关，也为香蕉细菌性枯萎病菌的疫情动态监测提供新的分子检测技术。

发明内容

本发明旨在提供一种香蕉细菌性枯萎病菌滚环扩增检测方法，首先设计锁式探针和其扩增引物，然后经过环化连接、消化反应，再用滚环扩增引物进行超分支滚环扩增，最后通过琼脂凝胶电泳成像来实现香蕉细菌性枯萎病菌的检测。

本发明根据Lee等获得的一段1884bp大小的香蕉细菌性枯萎病菌特异性片段（GenBank: AF450275），通过Blast与其近似种进行比对，在与其近似种碱基差异较大的地方找出一段序列作为T1、T2区，根据锁式探针的设计原则，设计锁式探针。并用Mfold（http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/）预测探针的二级结构，确保了锁式探针的二级结构最小。线性探针经过环化连接，探针两端的靶标序列就会与靶标DNA完全互补配对，线型锁式探针在Taq DNA连接酶的作用下被有效地连接成环型，而在没有相应目的DNA 存在时锁式探针不被连接酶连接，仅以线性形式存在，而后续反应中的核酸外切酶I、Ⅲ将多余的线性锁式探针消化水解。然后再用锁式探针的扩增引物进行超分支滚环扩增，凝胶电泳成像进行分析判断。

本发明的一种香蕉细菌性枯萎病菌锁式探针检测方法，具体操作的步骤如下：

（1）锁式探针环化连接

将锁式探针与香蕉细菌性枯萎病菌以及参照菌株的DNA模板分别进行环化连接，反应体系为10μL：10×Taq DNA连接酶缓冲液1μL，40U/μL的TaqDNA连接酶0.15μL，500pmol/L锁式探针0.2μL，DNA模板2μL，Sterilized ddH₂O补足至10μL。采用热循环连接法连接，反应条件为：94℃ 4 min；94℃30s，65℃5min，15个循环；95℃15min灭活Taq DNA连接酶。反应结束后立即将反应管冰浴5min。

（2） 消化反应