[发明专利]一种检测人基质金属蛋白酶‑12活性的荧光多肽底物

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有特定序列或基序的检测基质金属蛋白酶-12（MMP-12）的荧光多肽底物及其活性检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases， MMPs)是一类依赖钙离子的含锌的内肽酶家族，能够降解细胞外基质及基底膜中的多种成分，具有以下特点：①能降解细胞外基质及基底膜的成分；②以酶原形式分泌，激活后具有生物学活性；③依赖钙离子维持其稳定性；④能被内源性组织型金属蛋白酶组织抑制剂抑制。MMPs来源于多种组织及细胞，如内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及脑组织^[1-3]。MMPs不仅在正常生理情况下参与组织器官形态的发生、细胞迁移和血管生成等，也在病理性的重塑过程中发挥重要的作用，如类风湿性关节炎^[4]肿瘤的侵袭和转移^[5]及慢性阻塞性肺疾病^[6]、心血管疾病^[7]等。

基质金属蛋白酶-12(Matrix Metalloproteinases-12，MMP-12)又被称为人巨噬细胞弹性蛋白酶，1975年由Werb等^[8]首次在小鼠腹膜巨噬细胞中发现，1993年Shapiro等^[9]在吸烟者的肺泡巨噬细胞中成功克隆出MMP-12的cDNA序列。MMP-12以54-kDa的酶原形式分泌，分泌后自剪切掉氨基末端的序列，生成45-kDa的活性形式，再剪切掉羧基末端的序列生成成熟的22-kDa活性形式^[9,10]，MP-12的底物为弹性蛋白酶、Ⅳ型胶原、纤维结合蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、蛋白聚糖、硫酸软骨素、髓鞘碱性蛋白及α1-抗胰蛋白酶。在体内MMP-12、MMP-3、MMP-9、MMP-7以血纤维蛋白溶酶原为底物，血纤维蛋白溶酶原被水解后形成类血管抑制素的片段^[11]；MMP-12还能够激活其它的MMPs，如MMP-2及和MMP-3，放大并加速蛋白的降解^[12]。

研究发现MMP-12与多种疾病的发生与发展密切相关，如慢性阻塞性肺疾病^[6]、冠心病斑块破裂^[13]、主动脉夹层^[14]、腹主动脉瘤^[15]、创伤型深静脉血栓^[16]等。但是由于MMPs间的复杂相互作用机制及研究方法的限制，其具体作用机制仍未阐明。因此建立一个准确高效的MMP-12活性检测方法在了解MMP-12的功能及相关作用机制的研究中显得十分重要。

目前检测蛋白酶活性的主要方法有分光光度法、荧光法、同位素测定法、电化学方法等。由于荧光发发的灵敏度往往比分光光度法要高若干个数量级，荧光强度也和激发光的光源有关；荧光多肽合成、纯化方法较简便以及在实验过程中可避免离子强度、pH、温度等多种因素对实验结果的影响，在酶学研究中越来越多地被采用。

检测MMPs活性的荧光底物原理是在合成的蛋白酶底物两端分别偶联荧光发光基团和淬灭基团，可通过检测底物被切割后产生荧光的强度来检测蛋白酶切割反应的情况^[17, 18]。在无蛋白酶时，由于荧光核和猝灭剂相互彼此靠近,该完整肽链不具有内源性的荧光活性，当蛋白酶断裂该肽链，被分离的荧光核不能再被猝灭剂有效地猝灭而表现荧光活性，即可测定蛋白酶裂解底物在特定Ex/Em产生的荧光值。

目前报道了多种可被MMP-12水解的荧光多肽底物，但是特异性低，在被MMP-12水解的同时也可以与其它MMPs发生水解反应，例如美国Anaspec公司所合成的MMP-12荧光底物可同时被MMP-1、2、3、8和13酶切。临床血清样本中含有多种MMPs，MMP-12的功能是与多种家族成员及组织抑制剂共同调节完成的，由此以来使用这些荧光多肽底物检测血清中的MMP-12的活性便降低了检测的可靠性。不适合于临床检测MMP-12酶活性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性高的能检测MMP-12活性的荧光多肽底物及检测方法。

为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案如下：

使用化学合成的方法合成一种检测MMP-12酶活性的荧光多肽底物，该底物包括如PeptideⅠ所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第1位的异亮氨酸的氨基和第12位的赖氨酸的氨基分别结合有荧光基团和荧光猝灭基团。