[发明专利]基于ABCC3基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella (L.)，属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是一种世界性危害的重要蔬菜害虫，寄主多达40种以上，现已成为世界范围内十字花科蔬菜生产的重大障碍。小菜蛾主要以幼虫在十字花科蔬菜的整个生长期危害叶片，大大降低了蔬菜的产量和质量，个别田块严重发生时能减产90%以上，甚至绝产。小菜蛾之所以危害如此严重主要是因为对化学农药具有超强的适应性。目前，它几乎对用于防治其危害的各类杀虫剂都产生了不同程度的抗药性，这主要包括有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、昆虫生长发育调节剂以及生物源农药阿维菌素、多杀菌素和苏云金芽孢杆菌Bt等五十多种杀虫剂 (唐振华和周成理，1992)。

苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis，简称Bt) 是一种可产生杀虫晶体蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs，又被称为δ-内毒素) 的革兰氏阳性细菌。Bt很早即作为生物杀虫剂被广泛用于田间害虫防治，Bt制剂现已成为世界上应用最广的一类微生物杀虫剂。但是Bt制剂大量及不合理的使用最终造成了害虫产生Bt抗性。目前在世界范围内至少已有7种害虫被报道已经在田间产生Bt抗性，这其中包括2种害虫对Bt制剂产生抗性以及5种害虫对Bt作物产生抗性 (Tabashnik et al., 2011; Tabashnik et al., 2013)。由此可知，小菜蛾的Bt抗性问题已非常突出，因此为了更有效的使用Bt生物农药防治小菜蛾，开发有效地小菜蛾Bt抗性早期快速分子诊断技术就显得尤为重要。目前，尽管一些基于PCR方法的分子标记技术如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性) 已经用于小菜蛾抗性相关基因的寻找上，但这些标记并未直接用于小菜蛾抗性检测，小菜蛾Bt抗性检测仍局限于生物测定方法。然而，传统的生物测定方法有一些缺点：(1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性；(2)周期长：小菜蛾的Bt生物测定结果一般需要2天 (48小时) 以上；(3)对试虫数量要求很大：测定一个标准曲线完成一次生测至少需要约200头试虫，且对昆虫饲养的要求也很高。(4)操作麻烦且标准性不强：方法比较繁琐，操作起来比较复杂，从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化，尤其要求试虫的大小一致，不仅导致生测的工作量加大，而且诸多人为因素也会影响生测结果；(5)传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的LC₅₀和 LC₉₀值的重复性和精确性较低；(6)传统的生物测定方法对供试昆虫测得的抗性水平往往具有滞后性。

随着分子生物学技术进一步的飞速发展，人们已经将实时荧光定量PCR 技术 (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) 广泛应用于多种病毒、细菌的抗药性检测，并开始应用于转录水平上昆虫Bt抗药性靶标基因的表达量检测。实时荧光定量PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。相对于生测等常规Bt抗性检测手段，实时荧光定量PCR具有操作简单，灵敏度高，重复性好等优点，因而已开始成为昆虫抗药性靶标基因转录水平表达量检测的首选方法，在抗药性检测上日益显示出强大的优势。