[发明专利]一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本申请是申请号为：201310422992.2，申请日为：2013年9月17日，申请名称为：一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法和应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。

背景技术

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)能够水解淀粉分子内部α-1,4-葡萄糖苷键，水解产物为糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖，在食品、纺织、医药和饲料等工业领域广泛应用。碱性淀粉酶在强碱性条件下水解淀粉的潜力，使其可以应用于淀粉加工、纺织退浆以及用于自动洗衣机的洗涤剂添加等工业领域。碱性淀粉酶退浆主要应用α-淀粉酶催化淀粉大分子链水解，生成分子质量较小、黏度较低和溶解度较高的低分子化合物，再经水洗即可去除。这种方法可以节省大量时间、降低环境污染，同时将对纺织物本身造成的损坏降至最低程度，因而受到印染工作者的重视。为了满足印染行业连续化生产的要求，需要淀粉酶能够在高温下使用，但是目前大多数淀粉酶在高温下的稳定性较差。

定点突变和定向进化是提高工业用酶热稳定性的两种主要手段。定向进化虽然不需要准确的酶分子结构信息，但是需要建立一种能够从大量的突变株中快速简便的筛选到优势菌株的方法。而定点突变，与定向进化相比，是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶热稳定性的方法。本发明基于已得到的碱性淀粉酶在大肠中的表达平台，利用定点突变技术，对碱性淀粉酶进行分子改造，以期得到更适合工业应用的热稳定性提高的碱性淀粉酶。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，其相对亲本淀粉酶具有一个或多个氨基酸发生突变。

所述淀粉酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述发生突变的氨基酸位于淀粉酶蛋白结构的外表面(溶剂可接触面积大于100)或内表面(溶剂可接触面积小于5)，所述突变可以增强蛋白表面的静电相互作用或增强蛋白内部疏水相互作用。

所述一个氨基酸发生突变是淀粉酶第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸、第317位谷氨酰胺替换成精氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸或第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得单突变体分别命名为S66V、K98R、N166R、K192R、S258R、N275R、Q317R、Q349V、S438V。

所述多个氨基酸发生突变包括：

(1)第98位赖氨酸替换成精氨酸、第166位天冬酰胺替换成精氨酸、第192位赖氨酸替换成精氨酸、第258位丝氨酸替换成精氨酸、第275位天冬酰胺替换成精氨酸及第317位谷氨酰胺替换成精氨酸，所得6重突变体命名为K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R；

(2)第66位丝氨酸替换成缬氨酸、第349位谷氨酰胺替换成缬氨酸及第438位丝氨酸替换为缬氨酸，所得三重突变体命名为S66V/Q349V/S438V；

(3)将(1)、(2)中所述的9个位点同时进行突变，所得9重突变体命名为S66V/K98R/N166R/K192R/S258R/N275R/Q317R/Q349V/S438V。

本发明还提供一种所述淀粉酶突变体的制备方法，具体步骤如下：

1)根据SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，采用化学全合成的方法全合成基因后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ；

2)利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌淀粉酶(SEQ ID NO.1)进行模拟，获得淀粉酶空间结构，确定在淀粉酶催化结构域内进行氨基酸替换的位点；

3)设计突变引物，通过PCR对淀粉酶基因序列进行定点突变，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；

4)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，离心收集发酵上清，获得淀粉酶突变体。