[发明专利]基于锰过氧化物酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于锰过氧化物酶的工程菌及其实现方法。 

背景技术

木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，它涉及众多酶系的参与。木质纤维素中的木质素是由四种醇单体(对香豆醇、松柏醇、5‐羟基松柏醇、芥子醇)形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有联结强化细胞的作用。此外，木质素也是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。 

根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素(S‐木质素)，由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素(G‐木质素)和由对‐羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对‐羟基苯基木质素(H‐木质素)。一般而言，木质素在裸子植物主要存在类型为愈创木基木质素(G)，双子叶植物主要含愈创木基‐紫丁香基木质素(G‐S)，单子叶植物则为愈创木基‐紫丁香基‐对‐羟基苯基木质素(G‐S‐H)。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。 

木质素单体同时含有多种活性官能团，如羟基、羰基、羧基、甲基及其它侧链结构。其中羟基在木质素中存在较多，以醇羟基和酚羟基两种形式存在，而酚羟基的多少又直接直接影响木质素的物理和化学结构，如能反映出木质素的醚化和缩合程度，同时也能衡量木质素的溶解性能和反应能力；在木质素的侧链上，有对羟基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸等酯型结构存在，这些酯型结构存在于侧链的α位或γ位。在侧链α位除了酯型结构外，还有醚型连接或作为联苯结构的碳‐碳联结。同酚羟基一样，木质素的侧链结构也直接关系它的化学特性。 

由于木质素的复杂结构、高分子量及高度疏水性，与纤维素与半纤维素相比，木质素的降解相对缓慢。已发现木质素降解酶主要有3类：漆酶(Laccase)、锰过氧化物酶(Manganese  peroxidase)和木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase)。 

灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)作为一种广泛存在于土壤的细菌，具有很强的木质素降解能力并得到了研究者越来越多的关注。明确灰略红链霉菌降解木质素的分子机制，克隆并表达关键木质素降解酶，对于开发新型木质素降解酶制剂进而实现木质素乃至木质纤维素的快速降解具有重要意义。 

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN102703344A公开(公告)日2012.10.03，公开了一株秸秆降解放线菌及其应用，但该技术产生的锰过氧化物酶为胞内酶，产量较低因此应用范围受限。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的由于锰过氧化物酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于锰过氧化物酶的工程菌及其实现方法，能够应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成，此外本发明通过在重组蛋白添加聚组氨酸标签的方法，方便了后期蛋白的纯化，可为锰过氧化物酶的规模化发酵生产提供一种新的途径。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种锰过氧化物酶的工程菌，该工程菌为外源表达锰过氧化物酶的大肠杆菌。 

所述的胞内锰过氧化物酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1锰过氧化物酶基因SG‐MNP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该锰过氧化物酶核苷酸序列为2226bp，共编码741个氨基酸。 

所述的SEQ ID NO.1克隆自灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。 

所述的锰过氧化物酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。