[发明专利]基于木质素过氧化物酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于木质素过氧化物酶的工程菌及其实现方法。 

背景技术

木质素是由四种醇单体(对香豆醇、松柏醇、5‐羟基松柏醇、芥子醇)形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有联结强化细胞的作用。此外，木质素也是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。 

根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素(S‐木质素)，由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素(G‐木质素)和由对‐羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对‐羟基苯基木质素(H‐木质素)。一般而言，木质素在裸子植物主要存在类型为愈创木基木质素(G)，双子叶植物主要含愈创木基‐紫丁香基木质素(G‐S)，单子叶植物则为愈创木基‐紫丁香基‐对‐羟基苯基木质素(G‐S‐H)。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。 

木质素单体同时含有多种活性官能团，如羟基、羰基、羧基、甲基及其它侧链结构。其中羟基在木质素中存在较多，以醇羟基和酚羟基两种形式存在，而酚羟基的多少又直接直接影响木质素的物理和化学结构，如能反映出木质素的醚化和缩合程度，同时也能衡量木质素的溶解性能和反应能力；在木质素的侧链上，有对羟基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸等酯型结构存在，这些酯型结构存在于侧链的α位或γ位。在侧链α位除了酯型结构外，还有醚型连接或作为联苯结构的碳‐碳联结。同酚羟基一样，木质素的侧链结构也直接关系它的化学特性。 

由于木质素的复杂结构、高分子量及高度疏水性，与纤维素与半纤维素相比，木质素的降解相对缓慢。已发现木质素降解酶主要有3类：漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶(Manganese peroxidase)和木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase)。 

灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)作为一种广泛存在于土壤的细菌，具有很强的木质素降解能力并得到了研究者越来越多的关注。明确灰略红链霉菌降解木质素的分子机制， 克隆并表达关键木质素降解酶，对于开发新型木质素降解酶制剂进而实现木质素乃至木质纤维素的快速降解具有重要意义。 

经过对现有技术的检索发现：中国专利文献号CN103205403A公开(公告)日2013.07.17，公开了一种生产降解木质素酶的方法。该技术首先分别从微生物中克隆木质素过氧化物酶，锰过氧化物酶和漆酶基因；构建含上述三种基因表达框架的毕赤酵母表达载体和酿酒酵母表达载体，并将载体转化相应的宿主菌而获得工程菌。分别发酵毕赤酵母工程菌和酿酒酵母工程菌生产重组木质素过氧化物酶，锰过氧化物酶和漆酶。但该技术中的木质素过氧化物酶克隆自白腐真菌，真菌来源木质素过氧化酶对环境因素敏感，在高温和高pH下难以维持较高的生物学稳定性。 

中国专利文献号CN102703344A公开(公告)日2012.10.03，公开了一株秸秆降解放线菌及其应用，但该技术中涉及的木质素过氧化物酶在灰略红链霉菌内为表达酶，为诱导酶且表达量较低，难以满足生产需求。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的由于木质素过氧化物酶在生物体内多为胞内酶且表达量较低导致的应用范围和效果严重受限等不足，提出一种基于木质素过氧化物酶的工程菌及其实现方法，通过构建外源表达载体，优化蛋白诱导表达的条件和融合标签等方法，实现了木质素过氧化物酶的胞外过表达。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种木质素过氧化物酶的工程菌，该工程菌为外源表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌。 

所述的胞内木质素过氧化物酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1木质素过氧化物酶基因SG‐LIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该木质素过氧化物酶核苷酸序列为1278bp，共编码425个氨基酸。