[发明专利]一种白英愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法

权利要求书

1. 一种白英愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养与增殖等，主要步骤如下：

（1）取白英幼嫩叶片，按照常规的消毒方法对其进行灭菌处理；

（2）将步骤（1）灭菌处理过的白英叶片接入培养基配方为SH+NAA0.2mg/L+2ip1mg/l+水解酪蛋白250mg/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖3%，琼脂6g/L，PH5-6，暗室培养；

（3）取步骤（2）继代几次后培养出来的松散的愈伤组织放入液体培养基SH+2，4-D0.1-0.2mg/L+KT0.2-0.4mg/L+磷酸钙，进行悬浮细胞培养，附加蔗糖3%，PH6，光照3000lx，培养温度27℃；

（4）取步骤（3）悬浮培养出来的细胞进行鉴定，检测。

2. 按照权利要求1所述的一种白英愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（1）中所述白英无菌叶片的获得为：取白英幼嫩的叶片，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污渍，流水冲洗20min，超净工作台上氯化汞处理8min，无菌水冲洗5-7遍。

3. 按照权利要求1所述的一种白英愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（2）中所述愈伤组织的诱导采用的是暗室培养，并在培养基中附加水解酪蛋白，可以促进愈伤组织的生长。

4. 按照权利要求1所述的一种白英愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（3）所述的白英悬浮细胞按照下述方法得到：取诱导出来的愈伤组织继代4-5次后，取单一，松散的愈伤组织接种到盛有30mL培养基的100ml三角瓶中，接种后进行摇床水平振荡培养，可变速率95r/min，温度30℃，振幅2-4cm。

5. 按照权利要求1所述的一种白英愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（3）中在培养基中加入了固体缓冲物质磷酸钙可以缓冲悬浮培养中PH值的变化。

6. 按照权利要求1所述的一种白英愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于：步骤（4）中取悬浮培养出来的细胞接种在1mm厚的薄层固体培养基上进行平板培养，每个细胞团均来自一个细胞，然后对这些细胞株进行鉴定检测，筛选出次生代谢物含量高的细胞株进行大规模生产培养。