[发明专利]一种九里香悬浮细胞的快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种九里香悬浮培养的快繁方法，属于生物技术领域。

背景技术

九里香，又称：石辣椒、九秋香、九树香等，芸香科，Murraya exotica L.，小乔木，九里香喜温暖，最适宜生长的温度为20-32℃，不耐寒。常见于离海岸不远的平地、缓坡、小丘的灌木丛中。喜生于砂质土、向阳地方。九里香产于：云南、贵州、湖南、广东、广西、福建、海南、中国台湾等地，以及亚洲其他一些热带及亚热带地区。产台湾、福建、广东、海南、广西五省区南部。九里香叶含多种香豆精类化合物，从广东、云南、海南、台湾等各地产品中已分离得到：九里香甲素，九里香乙素，九里香丙素，长叶九里香内酯二醇，长叶九里香醛，5，7-二甲氧基-8-（3’-甲基-2'-酮基丁基）香豆精，海南九里香内酯等，行气活血；散瘀止痛；解毒消肿。主胃脘疼痛；跌扑肿痛；疮痈；蛇虫咬伤。主治跌打肿痛，风湿骨痛，胃痛，牙痛，破伤风，流行性乙型脑炎，虫、蛇咬伤，局部麻醉。用于胃痛，风湿痹痛；外治牙痛，跌扑肿痛，虫蛇咬伤。种植方法为种子繁殖，压条繁殖，扦插繁殖。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种九里香悬浮细胞的快速繁殖方法，由该方法所制备的九里香悬浮细胞生长速度快，可以获得较高的悬浮细胞，建立一个快速生长的悬浮细胞培养体系，维持其可持续开发和利用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的：

取九里香幼嫩的叶片，流水冲洗20min，超净工作台上0.1%的升汞处理8min，无菌水冲洗5次，吸水纸吸干，消毒处理过的九里香幼嫩的叶片接入MSB+IAA1.0mg/L+6-BA10mg/L+2mg/LKT培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗室培养，温度25℃，相对湿度75%，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基MSB+4-5μmol/L2,4-D+1-1.5μmol/L6-BA进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖50g/L，pH5.8，光照4500lx，温度25℃，接种密度为8%，125ml药瓶装25ml培养基，转速110r/min，悬浮培养两周后的出来的细胞放入附加了醋酸钠10mg/L+苯丙酸钠10mg/L的液体培养基中，30d后测定悬浮细胞的增长率。

采用本发明制备的悬浮细胞增长率高，周期短，产量大，污染小，利于大规模种植。

下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

具体实施方式

实施例1

取九里香幼嫩的叶片，流水冲洗20min，超净工作台上0.1%的升汞处理8min，无菌水冲洗5次，吸水纸吸干，消毒处理过的九里香幼嫩的叶片接入MSB+IAA1.0mg/L+6-BA10mg/L+2mg/LKT培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗室培养，温度25℃，相对湿度75%，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基MSB+4μmol/L2,4-D+1μmol/L6-BA进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖50g/L，pH5.8，光照4500lx，温度25℃，接种密度为8%，125ml药瓶装25ml培养基，转速110r/min，悬浮培养两周后的出来的细胞放入附加了醋酸钠10mg/L+苯丙酸钠10mg/L的液体培养基中，30d后测定悬浮细胞的增长率，增长率提高50%。

实施例2

取九里香幼嫩的叶片，流水冲洗20min，超净工作台上0.1%的升汞处理8min，无菌水冲洗5次，吸水纸吸干，消毒处理过的九里香幼嫩的叶片接入MSB+IAA1.0mg/L+6-BA10mg/L+2mg/LKT培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗室培养，温度25℃，相对湿度75%，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基MSB+5μmol/L2,4-D+1.5μmol/L6-BA进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖50g/L，pH5.8，光照4500lx，温度25℃，接种密度为8%，125ml药瓶装25ml培养基，转速110r/min，悬浮培养两周后的出来的细胞放入附加了醋酸钠10mg/L+苯丙酸钠10mg/L的液体培养基中，30d后测定悬浮细胞的增长率，增长率提高45%。

实施例3

取九里香幼嫩的叶片，流水冲洗20min，超净工作台上0.1%的升汞处理8min，无菌水冲洗5次，吸水纸吸干，消毒处理过的九里香幼嫩的叶片接入MSB+IAA1.0mg/L+6-BA10mg/L+2mg/LKT培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8，暗室培养，温度25℃，相对湿度75%，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基MSB+4μmol/L2,4-D+1.5μmol/L6-BA进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖50g/L，pH5.8，光照4500lx，温度25℃，接种密度为8%，125ml药瓶装25ml培养基，转速110r/min，悬浮培养两周后的出来的细胞放入附加了醋酸钠10mg/L+苯丙酸钠10mg/L的液体培养基中，30d后测定悬浮细胞的增长率，增长率提高47%。