[发明专利]一种鸦胆子悬浮细胞培养的快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及鸦胆子悬浮细胞培养的快繁方法，属于植物技术领域。

背景技术

鸦胆子，苦木科，Brucea javanica，常绿灌木或小乔木，生于海拔950-1000m的石灰山疏林中。产福建、台湾、广东、广西、海南和云南等省区；云南生于海拔950-1000米的旷野或山麓灌丛中或疏林中。亚洲东南部至大洋洲北部也有。以种子繁殖为主。鸦胆子含生物碱、糖甙、酚性成分和一种羟基羧酸称鸦胆子酸等。鸦胆子仁含脂肪油56.23%。油中不皂化物占1.36%，内含挥发油少许；皂化物92.7%，内含油酸81.87%、亚油酸3.37%、硬脂酸2.65%、棕榈酸6.62%等；还有熔点为152℃的绢丝状结晶体4.59%。种子中含多种结构上类似苦木素的苦味成分：鸦胆子苦醇、鸦胆子素A、B、C、D、E、F、G、H等。含鸦胆子甙，尚含多种苦味成分：鸦胆子苦素A、B、C、D、E、F、G、I，鸦胆子苦醇，以及生物碱鸦胆灵，此外，含鸦胆子甙A、B、C，并含脂肪油56.23%。鸦胆子油中除去三油酸甘油酯的剩余部分，经气—质联用分析，还含有软脂酸，硬脂酸，亚油酸，十七碳烷酸及花生酸。从茎中亦分离鉴定了鸦胆子苦醇，并有没食子酸乙酸大黄酚、大黄酚甙和β-谷甾醇，其中鸦胆子苦醇有较强的抗癌活性。鸦胆子也是一种重要的药用植物，治疗阿米巴痢疾，虐疾，滴虫性及阿米巴原虫性阴道炎，赘瘤，自古以来就延用的药用植物，以种子繁殖为主，扦插方法操作简单，遗传稳定性好，为鸦胆子的开发利用提供良好依据。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鸦胆子悬浮细胞的快速繁殖方法，由该方法所制备得到的鸦胆子悬浮细胞增殖率高，操作工艺简单可控，生长周期短，有利于鸦胆子有效成分的开发和利用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的：

取鸦胆子近芽处幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗20min，超净工作台上次氯酸钠消毒9min，同时均匀摇动，无菌水冲洗6-7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入MS+NAA0.2mg/L+KT1.0mg/L+链霉素15mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照强度1000lx，光期6h，暗期18h，诱导出来的鸦胆子愈伤组织接入MS+ABA1.5mg/L+IAA0.3mg/L+GA₃1.5mg /L+1g/L柠檬酸，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照1000lx，温度25-28℃，增殖后的愈伤组织筛选嫩绿松散的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L+4mmol/L叶酸+500mg/L椰乳，悬浮细胞使用摇床对其进行水平震荡培养，震荡频率90r/min，每60ml悬浮液接种入150ml三角瓶中，5周后称重计算增殖率。

采用本发明制备的鸦胆子增殖系数高，操作工艺简单可控，生长周期短，遗传稳定性好，能耗少，利于大规模生产。

下面将结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。

具体实施方式

实施例1

取鸦胆子近芽处幼嫩的叶片，在漂白粉中浸泡2min，毛刷去除表面被毛和污垢，流水冲洗20min，超净工作台上次氯酸钠消毒9min，同时均匀摇动，无菌水冲洗6-7遍，吸水纸吸去表面水分，消毒处理过的叶片接种入MS+NAA0.2mg/L+KT1.0mg/L+链霉素15mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加6.5g/L琼脂，30g/L蔗糖，光照强度1000lx，光期6h，暗期18h，诱导出来的鸦胆子愈伤组织接入MS+ABA1.5mg/L+IAA0.3mg/L+GA₃1.5mg /L+1g/L柠檬酸，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8，光照1000lx，温度25-28℃，增殖后的愈伤组织筛选嫩绿松散的愈伤组织接入液体培养基MS+NAA0.05mg/L+TDZ0.1mg/L+3mmol/L叶酸+500mg/L椰乳，悬浮细胞使用摇床对其进行水平震荡培养，震荡频率90r/min，每60ml悬浮液接种入150ml三角瓶中，5周后称重计算增殖率。

实施例2