[发明专利]基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的脲酶抑制剂的测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。

背景技术

脲酶（urease）是一种含镍的寡聚酶，它能高效、特异性催化尿素水解生成二氧化碳和氨。医学上，细菌脲酶是一种不容忽视的致病因素，它可诱发许多疾病，如肾盂肾炎、肝昏迷、消化性溃疡和感染性尿路结石等。脲酶抑制剂作为一种药物可溶解尿结石，阻止尿液生成新的晶体。农业上，当土壤脲酶的活性过高时，化肥中的尿素被迅速分解生成氨，排放到大气中，造成经济损失及环境污染。为了提高化肥中尿素氮的利用率，脲酶抑制剂的使用是一个极佳的选择。因此，脲酶抑制剂的筛选对医学及农业领域具有重要的现实意义。

近年来，荧光金属纳米团簇作为一种新型的荧光纳米材料备受关注。金属纳米团簇是指在一定的分子层（如硫醇）保护作用下，由几个到几百个金属原子构成的分子级聚集体，其直径一般小于2 nm，接近于电子的费米波长（约0.7 nm）。由于其独特的物理、电学和光学性质，金属纳米团簇在单分子光电、催化、生物成像和传感器等领域显示出广泛的应用前景。在所有的金属纳米团簇材料中，金纳米团簇（gold nanoclusters，AuNCs）因其具有化学性质稳定和生物相容性好等优点，是目前研究最多的一种金属纳米团簇材料。

本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇作为荧光探针，提供了一种简便、灵敏的脲酶抑制剂检测的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇为荧光探针的脲酶抑制剂的测定方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的基于荧光金纳米团簇的脲酶抑制剂测定方法,其特征是利用脲酶特异性催化尿素生成氨和二氧化碳的体系，新生成的氨能提高所述体系的pH值，使N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇的荧光发生猝灭，而脲酶抑制剂能阻止脲酶催化尿素分解这一过程，抑制荧光猝灭，从而用于脲酶抑制剂的检测。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0.6 mL浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液与0.4 mL浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2.5 h，反应液由浅黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液放置于4°C冰箱避光保存。

利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的发射光强度值（F₆₅₀）以判断脲酶抑制剂对脲酶活性的抑制作用，所使用的激发波长为355 nm。

将0.05 mL浓度为1.5 U/mL、pH=6.0的脲酶溶液加入到0.2 mL含有不同浓度脲酶抑制剂的1 mol/L、pH=6.0的尿素溶液中，混合均匀后在25 °C的恒温水浴槽中反应40 min，将0.2 mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，在25 °C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F₆₅₀值，计算抑制率，通过软件拟合得到脲酶抑制剂的IC₅₀。

将0.05 mL浓度为1.5 U/mL、pH=6.0的脲酶溶液加入到0.2 mL含有不同浓度巯基乙胺的1 mol/L、pH=6.0尿素溶液中，混合均匀后在25 °C的恒温水浴槽中反应40 min，将0.2 mL的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液加入到上述反应液中，再在25 °C的恒温水浴槽中反应3 min，测定发射光强度值F₆₅₀值，计算抑制率，通过软件拟合得到巯基乙胺的IC₅₀为2.8 μmol/L。