[发明专利]一种复合型荧光纳米探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物分析及生命科学领域，具体涉及一种检测ATP的复合型荧光纳米探针及其制备方法和应用。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)是广泛存在于生物细胞内的一种辅酶，由腺苷和三个磷酸基组成。自1929年Lohmann首次发现并提取ATP以来，它已被证实在生命细胞的新陈代谢以及各种生化反应的能量供应中扮演着极其重要的角色。作为细胞内能量传递的“分子通货”，ATP储存和传递化学能，是体内组织细胞所需能量的主要来源，参与蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成，对细胞许多代谢过程均有重要的调节作用。研究表明，ATP不但在恶性肿瘤的治疗中得到了广泛的应用，而且还作为重大疾病的标志物之一得到了广泛的研究和关注。由于ATP是活细胞赖以生存的能量来源，当细胞受损或死亡后，细胞内的ATP含量明显降低。因此，ATP的含量变化可以反映细胞的变异和损伤。通过检测恶性肿瘤ATP浓度变化，可以了解其细胞代谢情况，常被用于抗肿瘤药物的体外药敏检测，为恶性肿瘤药敏的异质性和个体化疗提供可行性治疗方案。另外，作为活细胞最基本的能量来源，ATP水平与活细胞数值呈正相关线性关系，因此，ATP也常作为微生物污染的一个指标，通过测定ATP含量的多少，可以直接反映细胞活性、微生物的数量。因此，建立快速、灵敏和准确的ATP分析方法不仅有助于癌症等重大疾病的早期诊断及治疗，同时对于临床医学、生命科学、食品卫生、环境监测、医药及化妆品等诸多领域也有着重要的实际意义。

目前，国内外ATP的检测方法除了作为主流技术的高效液相色谱法以外，其它还有电泳法、分光光度法和生物发光法等。这些方法在仪器设备、时间、灵敏度、准确性等方面都或多或少地存在不足，尤其是灵敏度和选择性尚待提高。为此，迫切需要开发高灵敏、高选择性的检测技术用于ATP的检测。

近几年来，金纳米笼作为一种新兴的纳米材料得到了广泛的关注。该纳米材料是一种中空多孔的结构，即笼状颗粒的内部为空心结构，光滑的笼壁表面上分布着小孔。与传统的球型金纳米颗粒相比，金纳米笼的局域表面等离子共振峰位于近红外区700～900nm，该波段对于生物医学意义重大，尤其是对于活体研究。将金纳米笼与DNA分子开关和DNA放大技术相结合的技术还未见文献报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，同时，也为了更加有效地利用具有特殊结构的纳米材料的显著优点，针对检测ATP的荧光纳米探针少有报道，因此，本发明的第一目的：构建并制备一种新型的可用于检测ATP的复合型荧光纳米探针，将具有DNA分子开关的金纳米笼材料与DNA放大技术结合在一起，使该复合型荧光纳米探针不但具有可控的分子开关，而且能够在解链反应后，释放出大量荧光分子，通过对荧光信号的检测实现对ATP的高灵敏检测；本发明的第二目的：提供一种该复合型荧光纳米探针的制备方法；本发明的第三目的：提供一种应用该复合型荧光纳米探针检测ATP的方法。将本发明提出的复合型荧光纳米探针用于ATP的荧光检测，能够有效提高ATP检测的灵敏度和准确度，显著降低样品用量。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明的复合型荧光纳米探针是以金纳米笼作为载体，利用其空心多孔的结构特性，在其内部装载荧光分子，为了防止荧光分子的外泄，通过在其表面组装DNA分子开关，将金纳米笼表面的孔封堵；其中，所述的DNA分子开关由3种DNA组成，其中DNA1、DNA2分别与DNA3互补，而DNA3不但含有切口酶识别序列还含有与引物链DNA4互补的序列。

优选地，上述复合型荧光纳米探针，其中所述的DNA1的部分序列为：5’-GGT CCA GCT GGC TTT TTT---SH-3’；

所述的DNA2的部分序列为：5’-SH---TTT TTT CCG TCG CAC GCT TTT-3’；

所述的DNA3的部分序列为：5’-GCC AGC TGG ACC TG GCT AAG GCA GCG TGC GAC GGT GGG GGA-3’；

所述的引物链DNA4的部分序列为：5’-AAT ACT CCC CCA CCG-3’。

优选地，上述复合型荧光纳米探针，所述的荧光分子是罗丹明B。

一种制备上述复合型荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别在DNA1、DNA2中加入DTT溶液进行活化处理1h；

(2)在磁珠-金纳米笼的复合物中加入活化好的DNA1、DNA2溶液，室温振荡过夜，使DNA1、DNA2组装到金纳米笼表面；