[发明专利]柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR 检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种针对柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR法检测用引物，其特征在于，所述引物的组成为：

柑桔黄脉病毒上游引物的基因序列如SEQ ID NO：1所示；

柑桔黄脉病毒下游引物的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种柑桔黄脉病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中含有权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中，柑桔黄脉病毒上游引物和下游引物的终浓度分别为50～500nM/L和50～500nM/L。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中还含有GoTaq qPCR Master Mix和H₂O。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液包括：

柑桔黄脉病毒上游引物：10mM、0.5μL；

柑桔黄脉病毒下游引物：10mM、0.4μL；

GoTaq qPCR Master Mix：10ug/ul、12.5μl；

CXR Refernce Dye：30uM、0.25μL；

ddH₂O：6.25μL。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括反转录体系，所述反转录体系中包括柑桔黄脉病毒下游引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录体系中，柑桔黄脉病毒下游引物的终浓度为50～500nM/L。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录体系包括：

9.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阴性对照品及阳性对照品中的至少一种。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括含有SEQ ID NO：3所示目的扩增序列的柑桔黄脉病毒质粒；所述阴性对照为DEPC-H₂O。

11.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所采用的PCR检测体系如下：

柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液     20μL

待测品                        5μL

反应总体系为                  25μL。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述待测品为样本核酸提取液反转录产物、阳性对照品或阴性对照品。

13.一种使用如权利要求1所述的引物或权利要求2-9任一权利要求所述试剂盒对柑桔黄脉病毒进行实时荧光定量RT-PCR检测的方法，步骤如下：

1)制备植物样本核酸提取液；

2)制备植物样本核酸提取液反转录产物；

3)加样：将柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液置于PCR管中，将植物样本核酸提取液反转录产物、阳性对照品或阴性对照品分别加入装有检测液的不同PCR管，获得对应的样本反应管、阳性反应管和阴性对照反应管；

4)PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

5)PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H₂O的最高点。

14.根据权利要求1所述的引物或权利要求2-9任一权利要求所述试剂盒在制备柑桔黄脉病毒检测试剂或诊断试剂中的应用。