[发明专利]柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR 检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种针对柑桔黄脉病毒的实时荧光定量RT-PCR检测用引物、试剂盒及检测方法。 

背景技术

柑桔黄脉病(Citrus yellow vein clearing disease,CYVCD)，也称柠檬黄脉病(Yellow vein clearing of Lemon)，是由柑桔黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起的。该病是Bové(1989)在巴基斯坦调查发现后命名的，Loconsole等(2012)通过深度测序技术，获得了柑桔黄脉病毒的全基因组，该病毒由7529个(GenBank Accession No.JX040635)核苷酸的正义RNA链组成，它是威胁柠檬生产的重要病害之一。主要症状表现为叶片侧脉及侧脉附近脉明、黄化，对光看更为明显，叶背可见侧脉处水浸状，部分叶片皱缩、反卷或船形叶，嫩叶症状表现明显，到老叶症状也不消失。主要导致光合作用降低、树势减弱、减产20％左右。柠檬黄脉病目前主要发生在印度、巴基斯坦、土耳其等国家。 

到目前为止，世界上对该病害的研究较少，大都停留在生物学特性研究方面，近年在我国云南瑞丽、重庆、江西、四川安岳等地柠檬上也发生类似症状，是我国柑桔上的新发病害。本人近几年研究结果表明该病害具有嫁接传染性，对所有柠檬、酸橙品种都具有嫁接传染性并具典型症状，对甜橙、宽皮柑桔也具有侵染性，但症状不明显；能侵染辣椒和豇豆；柑桔黄脉病最适宜发病温度为18～24℃，柑桔黄脉病病毒微粒为13～15×400～1000nm联合丝状，通过热处理结合茎尖嫁接脱毒方法能有效脱除该病毒。这些研究结果与国外研究报道的相关结果相同。 

柑桔黄脉病毒对我国柑桔，尤其是柠檬的生产造成了极其严重的损失。目前还缺乏对该病有效的防治方法，使用无病毒苗木是防治柑桔黄脉病唯一有效的方法。为保证种苗安全，必须对采穗母树和砧木进行定期监测，并及时清除田间病树，因此要求具备快速、灵敏的检测技术体系。 

当前在检测CYVCV时主要采用指示植物鉴定的方法，该方法的检测周期较长，无法 满足生长上大量、快速检测的需要。近年来，发明人创建的RT-PCR检测体系虽可对CYVCV进行快速检测，但无法对植株中CYVCV的含量进行定量分析，并且在植株发病早期，当病毒含量较低时可能无法对该病进行有效检测。为此，需要建立更为灵敏的实时RT-PCR检测体系。目前还没有运用实时RT-PCR检测CYVCV的报道。 

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的不足，提供一种利用实时荧光定量RT-PCR法对柑桔黄脉病毒(CYVCV)进行检测的引物、试剂盒及检测方法等，可用于柑桔黄脉病毒(CYVCV)的田间早期快速诊断及定量检测。 

本发明首先公开了一种针对柑桔黄脉病毒(CYVCV)的实时荧光定量RT-PCR法检测用引物，所述引物组成如下： 

上述针对柑桔黄脉病毒(CYVCV)的实时荧光定量RT-PCR检测用引物具体包括CYVCV上下游引物，用于扩增柑桔黄脉病毒(CYVCV)。 

本发明第二方面公开了一种柑桔黄脉病毒(CYVCV)实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。 

进一步的，所述试剂盒包括柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液中含有前述的引物，所述PCR扩增反应液能和该对引物的靶序列结合，产生高度灵敏、特异性高的检测信号。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液中还含有GoTaq qPCR Master Mix和H₂O。 

所述PCR扩增反应液中，引物、GoTaq qPCR Master Mix及H₂O均为常见组分，其含量亦为常规。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物(YSS-F)、CYVCV下游引物(YSS-R)的终浓度分别为50～500nM/L和50～500nM/L。 

更优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液的组成中，CYVCV上游引物(YSS-F)、CYVCV下游引物(YSS-R)的终浓度分别为200nM/L和200nM/L。 

较优的，所述柑桔黄脉病毒PCR扩增反应液包括： 

柑桔黄脉病毒上游引物：10uM、0.5μL；