[发明专利]一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法

权利要求书

1.一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

(1)建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型：

    将不同浓度的镉加入小鼠食物，根据小鼠的存活率确定致死剂量；然后在远低于致死剂量的前提下，选取一个安全的镉剂量作为研究对象；

(2)利用步骤（1）得到的毒性模型检测重金属镉中毒的生物学方法，具体步骤如下：

A. 通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白；

B. 筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算，其中差异蛋白相对表达

量数值变化越大，表明在镉的作用下该基因表达量变化越大，待测样品中镉含量就越大。

2.根据权利要求1所述的一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，

步骤A中所述通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白具体操作如下：

A-1. 小鼠血清和肝脏组织的的获取：通过眼球取血的方法获取试验小鼠的全血，静置离心得到小鼠血清；然后解剖小鼠，获取肝脏组织；

A-2.  血清蛋白中差异蛋白的筛选：去除血清白蛋白，测定蛋白浓度后，通过二维电泳筛选出生物体内蓄积镉诱导的差异蛋白；

A-3. 差异蛋白的鉴定：抠取二维电泳胶上的蛋白点，质谱鉴定差异蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，

步骤B中所述筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算具体操作如下：

B-1. 提取小鼠肝脏总RNA；

B-2. 小鼠肝脏中差异蛋白基因表达量的测定：

首先以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR合成cDNA第一链；然后以合成的cDNA为模版，根据差异基因的cDNA序列设计特异性引物和内参引物，进行Real time-PCR反应，并得到每个基因的Ct值：最后根据PCR得到的Ct值，计算出筛选到的差异蛋白在小鼠肝脏中的相对表达量。

4.根据权利要求1所述的一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，步骤A-3经质谱鉴定得到8个蛋白，包括4个下调蛋白：载脂蛋白A-Ⅳ，妊娠带蛋白，载脂蛋白A-Ⅰ前体，视黄醇结合蛋白；4个上调蛋白：淀粉体P成分前体，载脂蛋白E，载脂蛋白C-Ⅲ 前体，载脂蛋白A-Ⅱ。

5.根据权利要求1所述的一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，所述根据差异蛋白的cDNA序列，设计出符合Real time-PCR反应特点的特异性引物如下所示： 

。

6.根据权利要求1所述的一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，其特征在于，步骤B-2中所述差异蛋白在小鼠肝脏中的相对表达量利用下面公式计算：

基因相对表达量=2^-ΔΔCt；

ΔCt=Ct(目的基因) - Ct（β-actin）；

ΔΔCt=（Ct(目的基因)- Ct（β-actin））实验组 -（Ct(目的基因) - Ct（β-actin））对照组。