[发明专利]一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，属于生物体镉中毒的生物标志物检测领域。

背景知识

近年来，随着我国采矿、冶炼、陶瓷、电镀、及电子工业的迅猛发展，使镉、砷、汞等有害重金属通过废水、废气、废渣大量排放到自然界中，对耕地等土壤环境造成污染，同时也通过地表进入水体，流入海洋，导致了水体的严重污染。2014年4月我国公布最新的土壤污染调查公报显示，约16％的土壤遭受污染，其中重金属镉的污染约占7％，在过去的20年内增加了一倍，且有继续增加的趋势。这些镉在生物体内不易分解排放，蓄积在生物体内损伤机体并且中毒后难以发现，严重的威胁到人类的健康问题。因此，重金属镉的污染已经引起了全社会的关注，也是国内外学者面临的重要研究命题之一。

镉(Cd)的原子量为112.41，处于周期表ⅡB副族。镉溶于酸但不溶于碱，有Cd²⁺和Cd¹⁺两种氧化态。镉对动植物的危害较大，被镉污染的空气对人体危害严重。在上个世纪五十年代，日本富山县出现的“痛痛病”事件就是由于当地的冶炼厂排放的镉物质污染了水体和土壤，通过食物进入人体，使镉在体内蓄积而中毒致病的，患者出现了腰、背、手、脚等关节刺痛，骨骼变形易骨折的现象。根据美国国立卫生研究院(NIH)有毒物质数据库(HSDB)公布的信息可知，体内的镉大部分集中在肝脏及肾脏中，在骨骼和肌肉中也有相当量积累。体内和体外实验表明镉可以导致染色体损伤，还会影响基因的表达以及信号传导，目前研究表明过量的镉可以增加乳腺癌、肺癌、前列腺癌、睾丸癌和肾癌的发生几率。世界卫生组织(WHO)的国际癌症研究所(IRAC)把镉列为人类已知的致癌物，美国环保局把镉列为B1组人类致癌物。我国也是镉污染的重灾区，近年来不断的出现镉污染、镉中毒的事件，自2011年以来，中国多地市场发现大米镉含量超过国家规定的标准，引起了食品卫生部门的高度重视，这些食物中的镉通过食物链进入牲畜，最终进入人体，危害人体健康。这也使得对镉的研究显得尤为重要。

目前，世界各国也都十分重视重金属镉污染的检测和研究。现有检测镉的方法主要是通过化学反应以及紫外-可见光分光光度法、原子吸收光谱法等测定生物体中组织或者器官中镉的含量，对于哺乳动物主要是血液和尿液中镉的含量。但是镉在进入机体后经过血液进入肝脏，再进入肾脏，其会在器官中不断的迁移，所以在不同的时期、不同的器官中镉的含量都不稳定；在检测过程中还容易被外界环境污染，误差较大。另外，尿液中的β₂-微球蛋白、尿α₁-微球蛋白也是现有的检测镉中毒的一些指标，但是这些蛋白的变化都出现在肾脏受到损伤之后。因此这些传统的方法存在着操作麻烦费时、检出灵敏度低、特异性差和稳定性差的缺点，且不能及时的反应出生物体在镉诱导下生理、生化反应及代谢等方面的变化。本发明就是基于重金属镉对小鼠产生毒害的情况下，引起小鼠相关基因的变化而建立起来的一种快速、灵敏的人体镉中毒的有效检测方法，为镉中毒的防治提供了科学有效的检测依据。

本发明通过二维电泳这种非偏好型的筛选差异蛋白的方法，在小鼠血清中发现了一组镉诱导表达变化的蛋白，经质谱鉴定得到8个蛋白，包括4个下调蛋白载脂蛋白A-Ⅳ(Apolipoprotein A-IV，妊娠带蛋白(Pregnancy zone protein)，载脂蛋白A-Ⅰ前体(Apolipoprotein A-I precursor)，视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein)和4个上调蛋白淀粉体P成分前体(amyloid P-component precursor)，载脂蛋白E(Apolipoprotein E)，载脂蛋白C-Ⅲ前体(Apolipoprotein C-III precursor)，载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)。这组蛋白的变化或者其中某些蛋白的变化可以反应体内镉的情况，被认为可以作为检测机体内镉的生物标志物。这类标志物能实际的反映生物体在镉胁迫下其生理、生化反应及代谢等方面的变化，这种变化常早于重金属在生物体积累产生的毒害作用，且样品容易获取，能起到提前防治的作用。另外，利用血清中表达差异的蛋白作为重金属镉检测指标的研究还比较少。

发明内容

本发明的目的在于克服传统检测手段中存在的缺点和不足，提供一种快速、灵敏、高效的生物体重金属镉的分子生物学检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术法案如下：

(1)建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型：