[发明专利]一种快速灵敏检测小分子RNA的方法

权利要求书

1.一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取、纯化待检测小分子RNA；

（2）探针设计：根据待检测小分子RNA的碱基序列设计探针，所述探针用生物素或地高辛进行标记；

（3）液相杂交：将所述待检测小分子RNA与所述探针在缓冲液中进行杂交，并消化掉未杂交的单链序列，然后进行凝胶电泳；

（4）转膜：将电泳后的凝胶上的杂交产物转移到固相支持物上；

（5）抗体孵育：将步骤（4）所得到的含有杂交产物的固相支持物与特异性抗体进行孵育杂交；

（6）信号检测：检测步骤（5）所得的固相支持物上的信号。

2.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，还包括线性回归方程制作步骤：采用一系列浓度梯度的已知miRNA分别进行所述步骤（3）-（6）的操作，然后以已知miRNA的浓度为X轴，显色浓度为Y轴建立曲线坐标。

3.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，所述固相支持物为尼龙膜、纤维素膜和PVDF膜中的任何一种，优选尼龙膜。

4.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤（2）中，探针设计时，根据待检测小分子RNA的碱基序列，设计成DNA形式，根据此设计反向互补的寡核苷酸，并在5’端随机增加2个核苷酸后，再用生物素或地高辛标记。

5.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤（3）中所述凝胶为含1×TBE的 10%-15%的聚丙烯酰胺凝胶；步骤（3）中，杂交反应体系于95℃变性0.5 min以上，然后在42-65℃杂交0.5 min以上。

6.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤（3）中，用核酸外切酶消化了未杂交上的多余单链；杂交缓冲液中，磷酸根浓度为0-0.5 M，Na⁺浓度为0-1.5 M,EDTA浓度为0-0.5 M，pH为6.0-9.5。

7.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤（4）中，转膜时，根据凝胶的大小裁剪6张同样大小的滤纸，及1张固相支持物，按照从下到上依次为3层滤纸、凝胶、固相支持物、3层滤纸的顺序对齐摆放，然后将上述的滤纸、凝胶、固相支持物的“三明治”结构夹在两层湿润的固相支持物中间。

8.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤（5）中，先将含有杂交产物的固相支持物加入封闭液后在20-37℃下孵育1 min以上，弃封闭液，然后加入稀释的抗体，在20-37℃下孵育5 min以上。

9.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤（3）中，杂交反应体系于95℃变性5 min，然后在42℃杂交1h；步骤(5)中，先将含有杂交产物的固相支持物加入封闭液后在37℃下孵育5 min，弃封闭液，然后加入稀释的抗体，在37℃下孵育30 min。

10.如权利要求1所述的一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，其特征在于，步骤（6）中，采用CDP-Star检测方法或者X压片方法进行信号检测。