[发明专利]一种快速灵敏检测小分子RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物领域，特别涉及一种快速灵敏检测小分子RNA的方法。 

背景技术

小分子RNAs（miRNAs）是一类非编码的内源性RNAs，在多细胞物种乃至单细胞物种中都有被发现，小RNA可以反应转录到翻译水平的基因表达情况，因此，在不同组织和不同发育阶段，其表达量有很大的差异，不同小RNA之间也有很大差异。一系列的研究数据表明，小RNA（miRNAs）能够通过互补碱基修复模式在转录后水平上调控基因表达，也可以在DNA水平上通过促使DNA甲基化来调控基因表达。因此，小RNA在几乎所有生物学方面包括生理的，生化的，发育的及病理的反应过程中都起着重要的作用。此外，在活细胞中还有许多其他的非编码小分子RNAs，它们也在基因表达过程中起着重要而特别的作用，如21nt的siRNAs能够初始化RNA干扰从而对基因表达进行抑制，snRNA大概150nt，对于 剪切类反应起到了催化作用，26-31 nt的piwiRNAs参与信使RNA（mRNA）的降解和转录抑制。 

因此，要研究小RNA的功能和机制，必须掌握在活细胞生化过程中准确地测定小分子RNAs的方法。目前，小分子RNA检测包括下一代测序、Northern杂交、RT-PCR（实时PCR）及生物芯片。其中，下一代测序方法会得到大量的数据，需要人工及计算机进行长时间的分析和筛选，且需要用其他实验来验证；生物芯片的制作需要特别的工具材料及专业知识，普通实验室难以独立完成；RT-PCR虽然快速灵敏，但针对小RNA的检测，需要对反应的探针进行仔细的设计，且特异的探针花费较高。 

1.    Northern杂交可重复性高，结果好，经常作为RNA检测中的黄金标准来测定基因表达水平。但是传统方法灵敏度低，实验时间长，对人体和环境也有害。Wang等（Wang X, Tong Y, Wang S: Rapid and accurate detection of plant miRNAs by liquid northern hybridization. Int J Mol Sci 2010, 11:3138–3148）在2010年设计并提出了一种液相杂交快速检测小分子RNA的方法，弥补了传统Northern杂交耗时耗力并有危险性的缺点，但是，其灵敏度较低，约0.1pmol，不适用于检测表达量较低的小分子RNA。 Li等（Li X, Ni M, Zhang Y: Detecting miRNAs by liquid hybridization and color development. Methods 2012, 58:151-155.）在液相杂交的基础上提出了颜色观察法，将杂交后的核酸转移到膜上并通过免疫结合放大信号，使灵敏度提高到了2.5fmol。但是这种方法不能显示条带，从而无法区分序列相似的小分子RNA，也难以实现多种小分子RNA的检测。郭耀辉等在“生物素标记探针－液相杂交－非变性 ＰＡＧＥ检测非编码小 ＲＮＡ 方法的建立和优化”（国际检验医学杂志２０１２年３月第３３卷第６期）建立了生物素标记-液相杂交-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测非编码小RNA的方法，但这种方法由于无法去除多余探针，有较大的背景干扰问题，容易产生假阳性结果影响判断，难以实现灵敏、精确的检测。实际检测效果上，要获得较好的检测信号，该方法所需的探针浓度高达10 umol/L；并且所需的时间较长，从杂交到检出信号，不包括电泳分离和转膜所花的时间就需时5小时。 

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种兼顾灵敏度和检测效率的新的检测小分子RNA的方法。 

本发明采用的技术方案是这样的，一种快速灵敏检测小分子RNA的方法，包括以下步骤: 

（1）提取、纯化待检测小分子RNA；

（2）探针设计：根据待检测小分子RNA的碱基序列设计探针，所述探针用生物素或地高辛进行标记；

（3）液相杂交：将所述待检测小分子RNA与所述探针在缓冲液中进行杂交，并消化掉未杂交的单链序列，然后进行凝胶电泳；

（4）转膜：将电泳后的凝胶上的杂交产物转移到固相支持物上；

（5）抗体孵育：将步骤（4）所得到的含有杂交产物的固相支持物与特异性抗体进行孵育杂交；

（6）信号检测：检测步骤（5）所得的固相支持物上的信号。