[发明专利]包含具有与非纤维素物质降低的亲和力的纤维素酶变体的组合物和方法

说明书

本申请为2009年6月3日提交的、发明名称为“包含具有与非纤维素物质降低的亲和力的纤维素酶变体的组合物和方法”的PCT申请PCT/US2009/046159的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年12月6日，申请号为200980121072.9。

I.关于在联邦赞助的研究和研发中产生的发明的权利的陈述

本发明是在政府资助下产生的，具有能源部授予的条件授予编号：DE-FC36-08GO18078。政府对本发明享有一定权利。

II.相关申请的交叉引用

本申请要求2008年6月6日提交的美国临时申请号61/059,506的权益，其通过引用整合到本文中。

III.领域

本发明涉及酶，特别是纤维素酶变体。还描述了编码纤维素酶变体的核酸，包含纤维素酶变体的组合物，鉴别其它有效的纤维素酶变体的方法，以及使用组合物的方法。

IV.背景

纤维素和半纤维素是由光合作用产生的最丰富的植物材料。它们可以被多种微生物(例如，细菌、酵母和真菌)降解并用作能源，所述微生物产生能够将多聚底物水解为单体糖的胞外酶(Aro等人，J Biol Chem,276:24309-24314,2001)。由于不可再生来源途径的限制，纤维素成为主要的可再生能量来源的可能性是极大的(Krishna等人，Bioresource Tech,77:193-196,2001)。通过生物学过程有效的利用纤维素是克服食物、饲料和燃料短缺的一种方法(Ohmiya等人，Biotechnol Gen Engineer Rev,14:365-414,1997)。

纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷连接)，导致葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等形成的酶。纤维素酶传统上分为三大类：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶(β-D-葡糖苷葡糖水解酶，EC 3.2.1.21)(“BG”)(Knowles等人，TIBTECH 5:255-261,1987；和Schulein,Methods Enzymol,160:234-243,1988)。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的无定形部分上，而纤维二糖水解酶还能够降解结晶纤维素(Nevalainen和Penttila,Mycota,303-319,1995)。因此，使结晶纤维素有效溶解需要纤维素酶系统中存在纤维二糖水解酶(Suurnakki等人，Cellulose 7:189-209,2000)。β-葡糖苷酶的作用是从纤维二糖、纤维寡糖和其他葡糖苷中释放出D-葡萄糖单元(Freer,J Biol Chem,268:9337-9342,1993)。

已知多种细菌、酵母和真菌生产纤维素酶。一些真菌生产完整的纤维素酶系统，所述系统能够降解结晶形态的纤维素，使得通过发酵可以方便的大量生产纤维素酶。由于许多酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)缺少水解纤维素的能力，因此丝状真菌扮演了特殊的角色(参见例如，Wood等人，Methods in Enzymology,160:87-116,1988)。

CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可以进一步扩展至在每个分类中包括多个组分。例如，已经从多种真菌来源中分离出多个CBH、EG和BG，包括里氏木霉(Trichoderma reesei)(也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))，其含有以下已知基因：两种CBH，即CBHI(“CBH1”)和CBHII(“CBH2”)；至少8种EG，即EG I、EG II、EG III、EGIV、EGV、EGVI、EGVII和EGVIII；以及至少5种BG，即BG1、BG2、BG3、BG4和BG5。EGIV、EGVI和EGVIII也具有木葡聚糖酶的活性。

为了将结晶纤维素有效转化为葡萄糖，需要完整的纤维素酶系统，其包括来自CBH、EG和BG分类中的每种的组分，以及水解结晶纤维素时较不有效的分离组分(Filho等人，Can J Microbiol,42:1-5,1996)。在来自不同分类的纤维素酶组分之间已观察到协同关系。特别是EG类纤维素酶和CBH类纤维素酶协同的相互作用，更有效的降解纤维素。