[发明专利]使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法

权利要求书

1.一种使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1）将携带包含 GUS 基因的 pCAMBIA2301 质粒的农杆菌菌液在固体培养基上划线后挑取单菌落在液体培养基中于28℃摇菌培养至菌液OD600为0.8～2.4，将菌液离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS 液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定菌液OD600在0.8～2.4，将重悬后的菌液放于冰箱备用；

2）用无菌注射器将步骤（1）得到的重悬后的菌液注射至果实中；

3）摘取注射后第三天至第七天之间的果实，切成薄片，放入GUS染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用体积浓度70%酒精去除叶绿素后统计转化效率；

4）摘取注射后第三天至第七天之间的果实，提取果实RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，检测gus基因表达量。

2.根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤1）中农杆菌为根癌农杆菌EHA105、AGL0和GV3101中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤1）中菌液OD600为0.8～1.2。

4.根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤1）中固体培养基为： LB固体培养基50 mL+卡那霉素50mg /L+利福平100mg/ L，其中LB固体培养基配方：每一升LB固体培养基中包含胰蛋白胨 10g,酵母提取物 5g,氯化钠 10g以及琼脂 15g。

5.根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤1）中液体培养基为：LB液体培养基50 mL+卡那霉素50mg /L+利福平100mg/ L；其中LB液体培养基配方：每一升LB液体培养基中包含胰蛋白胨 10g,酵母提取物 5g,氯化钠 10g。

6.根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤2）中果实为草莓品种“红颜” 每年3 -5月不同成熟期的果实，此时按照不同的发育时期分为七个不同的时期，第一个时期为种子刚刚完全形成，并且密集的分别在草莓果实周围，花托并不能看清楚；第二个时期为花托可以清晰的看见，果茎大约为0.3～0.5厘米；第三个时期为果实开始膨胀，果实变得很大，果茎大小约为0.8～1.5厘米；第四个时期为草莓果实开始从绿果向白果转化；第五个时期是草莓果实白果期，果实完全变为白色；第六个时期和第七个时期为红果期，红果期也可以分为两个时期，一个是果实开始变红大约一半左右，另一个时期果实完全为红色。

7.根据权利要求6所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述果实采用第四个时期和第五个时期的果实。

8.根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤2）中注射位置选择果柄处，注射量为直到菌液溢出为止。

9.根据权利要求1所述的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，其特征在于，所述步骤3）、步骤4）中摘取注射后第五天的果实。