[发明专利]使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法

说明书

技术领域

本发明属于草莓的瞬时转基因技术和瞬时基因表达分析领域，尤其涉及一种使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法。

背景技术

草莓（Fragaria×ananassa）是一种经济价值较高的作物。 由于草莓的杂合性和多倍性，种间或种内杂交通常难以获得杂种，常规育种工作量大、效率低。随着基因工程和生物技术的飞速发展，可以利用转基因的方法来有效改良草莓品种，缩短育种周期，提高育种效率。草莓转基因发展非常迅猛，在基因测序和克隆方面，国内近几年研究了与草莓相关的50多种基因，有些已经转到草莓体内并得到表达。

通过近几年草莓基因工程的发展，已在草莓中分离得到了许多与果实的形成发育以及成熟生理代谢等相关的重要功能基因，对这些基因的功能进行鉴定是非常重要的研究目标之一。而基因的功能验证的一个重要途径就是通过转基因操作来进行。草莓转基因研究在园艺作物中开展较早，早在80年代就已经成功获得了草莓转基因的植株。其中根癌农杆菌介导的叶盘转化法是草莓遗传转化中最常用的方法。但如果采用常规叶盘转化法进行转基因来研究基因的功能就需得到转基因植株，并在其开花结果后才能观察分析，而草莓转基因试验周期长，一般从开始转基因到获得转基因植株，到植株开花结果需要1-2年的时间，费时费力，对于研究一些功能尚未明确的基因来说时间周期过长，所需人力也很大。此外稳定基因转化也不适于研究一个家族大批量的基因功能，一般研究的基因数量比较小，因此需要寻求一种新的，快速的方法来研究与果实的形成发育以及成熟生理代谢等相关的重要基因的功能。

果实注射法是近年来以园艺作物果实为转化材料发展起来的一种对目的基因进行转化从而鉴定其功能的新方法，该方法操作简便，周期短。一般注射后一周左右便可以可直接观察转化后果实的形态以及生理等方面的变化，也可以对果实进行分子生物学相关的检测研究来确定基因功能，从而研究导入基因的功能与作用。最初的果实注射法以注射某些药物来观察果实的生长发育状况， 2001年国外科学家首次利用该方法进行转化梨、苹果、番茄、桃、草莓果实细胞的研究。2008年有报道利用果实注射法研究了基因在草莓果实中的功能。而且这些注射法多采用的是离体果实注射，这样就不能完全反应果实的生长以及发育过程的变化状况。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速，便捷的使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下的技术方案来实现的。

一种使用农杆菌注射转化草莓果实的操作方法，该方法包括如下步骤：

1）将携带包含 GUS 基因的 pCAMBIA2301 质粒的农杆菌菌液在固体培养基上划线后挑取单菌落在液体培养基中于28℃摇菌培养至菌液浓度为0.8～2.4，将菌液离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS 液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定菌液浓度在0.8～2.4，将重悬后的菌液放于冰箱备用；

2）用无菌注射器注射农杆菌悬浮液至果实中；

3）摘取注射后第三天至第七天之间的果实，切成薄片，放入GUS染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用体积浓度70%酒精去除叶绿素后统计转化效率；

4）摘取注射后第三天至第七天之间的果实，提取果实RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，检测gus基因表达量。

所述步骤1）中农杆菌为根癌农杆菌EHA105、AGL0和GV3101中的任意一种，优选AGL0。

所述步骤1）中固体培养基为 LB固体培养基+卡那霉素50mg /L+利福平100mg/ L，液体培养基为LB液体培养基+卡那霉素50mg /L+利福平100mg/ L。

所述步骤1）中菌液浓度为0.8～2.4，菌液浓度在0.8～1.2时转化效率都比较高，菌液浓度高于1.2，不仅转化效率会下降，而且注射后会导致果实腐烂坏死。

所述步骤2）中果实为草莓品种“红颜” 每年3 -5月不同成熟期的果实，此时按照不同的发育时期分为七个不同的时期，第一个时期为种子刚刚完全形成，并且密集的分别在草莓果实周围，花托并不能看清楚；第二个时期为花托可以清晰的看见但是果实还是很小；第三个时期为果实开始膨胀，果实变得很大；第四个时期为草莓果实开始从绿果向白果转化；第五个时期是草莓果实白果期，果实完全变为白色；第六个时期和第七个时期为红果期，红果期也可以分为两个时期，一个是果实开始变红大约一半左右，另一个时期果实完全为红色，优选第四个时期和第五个时期的果实。