[发明专利]一种腺苷高产微生物菌株的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种腺苷高产微生物菌株的高通量筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行： 

（1）挑取腺苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800 rpm摇床培养8-14 h；

（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30-40℃、300-800 rpm摇床培养8-48 h；

（3）将深孔板II放置于孔板离心机，5000-10000×g离心5-30 min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清适当稀释；

（4）在酶标板的微孔中加入适当稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的腺苷脱氨酶，以不加腺苷脱氨酶的实验为空白对照，于30-40℃温浴反应10-40 min；

（5）反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于30-40℃温浴反应20-50 min；

（6）步骤（5）反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据腺苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算腺苷产量；

（7）根据腺苷检测结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得腺苷高产菌株，

其中，所述反应液A包含：氢氧化钠20-30 g/L、水杨酸45-75 g/L和亚硝基铁氰化钠1-3 g/L；反应液B包含：次氯酸钠40-60 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695-700 nm，或

所述反应液A包含苯酚15-30 ml/L和亚硝基铁氰化钠0.8-3 g/L，反应液B为包含氢氧化钠10-15 g/L和次氯酸钠20-40 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625-630 nm。

2.权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述腺苷生产菌的单菌落为自然界含菌样品或通过物理化学等诱变方法获得的突变株。

3.权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述的深孔培养板为96孔深孔板，每个孔的体积是3 mL，但是每孔中加入0.5-2.5 mL的培养基。

4.权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述溶液种子培养基为：酵母粉2-10 g/L，蛋白胨5-15 g/L，氯化钠5-15 g/L，pH7.0、121℃灭菌20 min。

5.权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述发酵培养基为：葡萄糖 10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 8.96 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，NaCl 2.5 g/L，尿素 2 g/L，L-色氨酸 0.05 g/L，1000×微量元素 1 mL，MgSO₄·7H₂0 0.49 g/L，CaCl₂  0.011 g/L，

其中，所述1000×微量元素组分为：MnCl₂ 1 g/L，ZnCl₂ 1.7 g/L，CuCl₂·2H₂O 0.43 g/L，CoCl₂·6H₂O 0.6 g/L，FeCl₃ 8.125 g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.6 g/L，

所述各组分灭菌条件为：葡萄糖 110℃灭菌20 min，尿素和色氨酸过滤除菌，其它组分121℃灭菌20 min。

6.权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述的上清液中不能含有菌体，稀释后的上清液与所述缓冲液混合均匀，稀释后的上清液中腺苷的浓度为0.01-10 mM。

7.权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述酶反应所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液和HEPES缓冲液之中的一种，所述缓冲液的pH为7.0-8.0，浓度为0.01-0.1 M。

8.权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述腺苷脱氨酶来源于人或大肠杆菌，反应时加入1-20 U腺苷脱氨酶。