[发明专利]一种腺苷高产微生物菌株的高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种腺苷高产微生物菌株的高通量筛选方法，属于微生物育种和发酵工程技术领域。

背景技术

腺苷（adenosine）即腺嘌呤核苷，是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用，是急诊处理快速性心律失常和药物负荷试验的常规药物，已证实它具有心脏保护作用，可增强心肌对缺血的耐受力，减少心肌的再灌注损伤，减小梗死面积。腺苷同时还是一种重要的医药中间体，可合成多种药用核苷类物质，如8-氮腺苷、三磷酸腺苷（ATP）、腺苷酸、阿糖腺苷等。

目前，腺苷的生产主要以肌苷为原料进行化学合成，生产成本仍偏高，为35-40万元/t左右，采用糖质原料直接发酵生产腺苷则成本很低，如果发酵水平达到20g/L以上，提取总收率80%以上，则生产成本可控制在10万元/t以下。因此，腺苷的发酵法工业生产如果获得成功及发酵水平的提高，将像肌苷发酵一样，对我国的核苷发酵工业起很大的推动作用。而工业发酵生产腺苷的核心是获得性能优良的微生物菌种。

在微生物代谢过程中，腺苷作为产物会被释放到培养基中，为了验证微生物生产腺苷的能力，需要测定培养基中腺苷的含量。目前腺苷测定的常用方法主要包括纸层析法和高效液相色谱法。纸层析法检测腺苷精度不高，而且所用的有机溶剂如丙酮等，一般有挥发性、并有一定毒性。高效液相色谱法能检测微量腺苷，精密度和准确性很高，但仪器昂贵、操作和维护繁琐。另外，还有基于腺苷与其适体特异性识别和腺苷适体偶联金纳米粒子自组装导致共振光散射信号放大建立的腺苷检测新方法，但仍处于实验室研究阶段。专利CN103320326A虽然建立了一种高通量筛选方法，即通过全波长扫描比较。这种方法受培养基成分影响很大，而且检测不够灵敏。因此，寻求简便、快速、准确和应用广泛的腺苷分析法倍受重视。

采用高通量方法筛选腺苷高产菌株，即可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高筛选速度。开发一种简便、快速、准确的方法检测发酵液中的腺苷含量，对于高通量筛选生产腺苷的菌株进行腺苷生产具有重要意义。

发明内容

为了克服筛选腺苷高产菌株的常规方法存在的工作量大、周期长和成本高等问题，本发明提供了一种基于深孔板的微型化培养与基于酶标仪微量化检测的高通量筛选方法。高通量筛选腺苷高产菌株的方法如下：

（1）挑取腺苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800 rpm摇床培养8-14 h；

（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30-40℃、300-800 rpm摇床培养8-48 h；

（3）将深孔板II放置于孔板离心机，5000-10000×g离心5-30 min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清适当稀释；

（4）在酶标板的微孔中加入适当稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的腺苷脱氨酶，以不加腺苷脱氨酶的实验为空白对照，于30-40℃温浴反应10-40 min；

（5）反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于30-40℃温浴反应20-50 min；

（6）步骤（5）反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据腺苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算腺苷产量；

（7）根据腺苷检测结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得腺苷高产菌株，

其中，所述反应液A包含氢氧化钠20-30 g/L、水杨酸45-75 g/L和亚硝基铁氰化钠1-3 g/L，反应液B包含次氯酸钠40-60 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695-700 nm。

在另一优选例中，所述反应液A包含苯酚15-30 ml/L和亚硝基铁氰化钠0.8-3 g/L，反应液B为包含氢氧化钠10-15 g/L和次氯酸钠20-40 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625-630 nm。

在另一优选例中，所述腺苷生产菌的单菌落为自然界含菌样品或通过物理化学等诱变方法获得的突变株。

在另一优选例中，所述的深孔培养板为96孔深孔板，每个孔的体积是3 mL，但是每孔中加入0.5-2.5 mL的培养基。

在另一优选例中，所述溶液种子培养基为：酵母粉2-10 g/L，蛋白胨5-15 g/L，氯化钠5-15 g/L，pH7.0、121℃灭菌20 min。